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    鐵調(diào)素對人成骨細(xì)胞增殖、凋亡、鈣化功能的影響

    2012-09-05 02:10:12陳丕績
    海南醫(yī)學(xué) 2012年1期
    關(guān)鍵詞:鐵調(diào)素成骨細(xì)胞骨質(zhì)

    陳丕績

    (深圳市鹽田區(qū)人民醫(yī)院檢驗科,廣東 深圳 518081)

    骨質(zhì)疏松(Osteoporosis)主要指由于多種原因引發(fā)的、以單位體積內(nèi)骨組織量減少為主要特點的代謝性骨類疾病[1],隨著社會老齡化的加劇,骨質(zhì)疏松的發(fā)病率越來越高,其發(fā)病緩慢,以骨骼疼痛或易于骨折為主要特征,尤以老年人發(fā)病率居高。骨質(zhì)疏松進(jìn)展無明顯體征,不易被患者發(fā)現(xiàn),短期內(nèi)無法治愈,是引發(fā)一系列骨科疾病的主要病因之一,嚴(yán)重影響患者健康和生活質(zhì)量。成骨細(xì)胞目前是骨質(zhì)疏松相關(guān)研究的主要組織平臺,由于骨質(zhì)疏松從病理學(xué)改變方面研究,是成骨細(xì)胞中的Ⅰ型膠原分泌量明顯減少,使鈣結(jié)節(jié)形成受限,進(jìn)而產(chǎn)生骨質(zhì)的變化[2]。研究表明,鐵過量或鐵分布錯位是造成骨質(zhì)疏松的一個重要因素[3],鐵調(diào)素具有鐵過量的下調(diào)作用,因而對成骨細(xì)胞的生物活性可能存在一定的影響作用。本文通過對人成骨細(xì)胞株的培養(yǎng)實驗,探討鐵調(diào)素在人成骨細(xì)胞增殖、凋亡、鈣化方面的作用和影響。

    1 資料與方法

    1.1 成骨細(xì)胞制備 人成骨細(xì)胞(hFOB1.10)由中國科學(xué)院上海細(xì)胞所細(xì)胞庫提供,置于5%CO2和34℃環(huán)境下培養(yǎng),培養(yǎng)基采用DMEM(高糖):F12=1:1+10%胎牛血清+0.3‰G418(Amersco公司提供),培養(yǎng)3~4 d,檢測細(xì)胞密度達(dá)90%后,使用胰蛋白酶消化,再分種于12孔的培養(yǎng)板上,培養(yǎng)板上每孔置入一塊無水乙醇處理過的圓形蓋玻片。

    1.2 設(shè)備及試劑 鐵調(diào)素由日本Peptide機構(gòu)生產(chǎn),MTT溶液由(0.5 g MTT+100 ml磷酸緩沖液(PBS)+0.22μm濾膜過濾)自行配置,二甲基亞砜(DMSO)由上海青鴻化工有限公司提供,碧云天由BestBuo貝博生物公司提供,蔡司熒光顯微鏡由Carl Zaiss公司生產(chǎn),流式細(xì)胞儀由Beckman Coulter公司生產(chǎn)。

    1.3 分組及檢測方法

    1.3.1 增殖活性 鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞增殖活性的影響采用MTT法檢測。取置備好的血清培養(yǎng)液,配置hFOB1.10細(xì)胞為濃度2×104個/m細(xì)胞懸液,取96孔培養(yǎng)板接種,每孔100μl,于34℃、飽和濕度、15%CO2環(huán)境下培養(yǎng)至形成單層細(xì)胞,吸棄培養(yǎng)液后,取18孔分為三組,100 nmol/L組、200 nmol/L組和對照組,各6孔。100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調(diào)素,200 nmol/L組加入200 nmol/L鐵調(diào)素,對照組不加入鐵調(diào)素。各組均間隔24 h換液,并于培養(yǎng)48 h后用PBS洗滌,再分別加入無血清培養(yǎng)液200μl及MTT溶液200μl,4 h后吸棄培養(yǎng)液,再于各孔加入DMSO,采用酶聯(lián)免疫檢測儀進(jìn)行吸光度OD490檢測,比較鐵調(diào)素對成骨細(xì)胞增殖的作用。

    1.3.2 凋亡檢測 取置備好的血清培養(yǎng)液,配置hFOB1.10細(xì)胞為濃度2×105個/m細(xì)胞懸液,于6孔板接種每孔2 ml,24 h后棄培養(yǎng)基,分100 nmol/L組、200 nmol/L組和對照組三組,100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調(diào)素、200 nmol/L組加入200 nmol/L鐵調(diào)素,對照組不加鐵調(diào)素。34℃、飽和濕度、5%CO2環(huán)境下間隔24 h換液,48 h后用胰酶消化,PBS洗滌,碧云天混合于室溫孵育10 min,離心吸棄上清液,冰浴避光10 min,流式細(xì)胞儀檢測成骨細(xì)胞凋亡率。

    1.3.3 鈣化功能 采用鈣結(jié)節(jié)染色法,12孔培養(yǎng)板上分種1×105個/孔細(xì)胞,間隔24 h行培養(yǎng)基更換,同樣分三組,對照組加入100μl雙蒸水,100 nmol/L組加入100 nmol/L鐵調(diào)素、200nmol/L組加入200nmol/L鐵調(diào)素。間隔24 h更換培養(yǎng)基,15 d棄培養(yǎng)基,以4%多聚甲醛行30 min固定,后PBS洗滌2~3次,加入5%硝酸銀,置于陽光下暴曬30 min,再次PBS洗滌,加入5%硫代硫酸鈉靜置2 min,PBS再次漂洗2~3次,1%中性紅復(fù)染,10 min后PBS洗滌兩次,于光學(xué)顯微鏡下對各組鈣結(jié)節(jié)形成情況進(jìn)行觀察。

    1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS13.0統(tǒng)計學(xué)處理軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,計量資料采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,F(xiàn)檢驗。P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

    2 結(jié) 果

    2.1 成骨細(xì)胞增殖活性 MTT法檢測結(jié)果詳見表1,三組成骨細(xì)胞增殖活性接近,經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(F=2.38,P>0.05)。

    2.2 成骨細(xì)胞凋亡檢測 隨著鐵調(diào)素劑量的減少,成骨細(xì)胞凋亡率逐漸增高,數(shù)據(jù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.28,P<0.05),見表1。

    2.3 成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)形成 利用鐵調(diào)素分組實驗15 d后,染色的三組經(jīng)觀察可見細(xì)胞外基質(zhì)礦化鈣結(jié)節(jié)形成,利用光學(xué)顯微鏡觀察,鈣化灶呈黑色,散點狀分布且不均勻。采用顯微鏡標(biāo)尺和培養(yǎng)板密度共同測量成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)數(shù)量,結(jié)果見表1,隨著鐵調(diào)素干預(yù)的減少,鈣結(jié)節(jié)計數(shù)呈下降趨勢,三組成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)計數(shù)經(jīng)統(tǒng)計學(xué)比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.28,P<0.01)。

    表1 三組細(xì)胞增殖活性、凋亡檢測及鈣結(jié)節(jié)計數(shù)比較(±s)

    表1 三組細(xì)胞增殖活性、凋亡檢測及鈣結(jié)節(jié)計數(shù)比較(±s)

    組別200 nmol/L組100 nmol/L組對照組成骨細(xì)胞增殖活性(nmonl/L)0.74±0.140.72±0.230.73±0.09成骨細(xì)胞凋亡率(%)2.38±0.334.96±0.417.32±0.32成骨細(xì)胞鈣結(jié)節(jié)計數(shù)(個)287±15145±945±6

    3 討論

    鐵調(diào)素又被稱為“肝臟抗菌多肽”,21世紀(jì)初才經(jīng)由兩個獨立實驗室分別從人類血清及尿液中提取而成[3]。研究表明鐵調(diào)素對于人體內(nèi)鐵元素狀態(tài)的調(diào)節(jié)以及腸道內(nèi)鐵吸收的活性有著十分關(guān)鍵的作用[4]。鐵元素廣泛的參與到人體肌紅蛋白、血紅蛋白的合成當(dāng)中,是細(xì)胞色素氧化酶的組成成分,對線粒體電子傳遞有參與作用,為三羧酸循環(huán)中的酶及其他因子提供有效的鐵環(huán)境,對人體的代謝及呼吸功能有很大的影響效應(yīng)[5]。近些年來,隨著骨科病理研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)成骨細(xì)胞內(nèi)Ⅰ型膠原的分泌減少和鈣結(jié)節(jié)的形成減少是骨質(zhì)疏松的主要成因,在骨重建系統(tǒng)中,成骨細(xì)胞的激活對于鐵元素具有很強的敏感性,但巨噬細(xì)胞分化形成的破骨細(xì)胞,卻能夠在大量的鐵沉積環(huán)境下正常生長,促使鐵過量或鐵分布錯位成為骨質(zhì)疏松的一個重要誘發(fā)因素[6]。因而,鐵調(diào)素對鐵過量或鐵分布錯位的有效調(diào)節(jié)可能為成骨細(xì)胞的生長提供良好的體內(nèi)環(huán)境,對骨質(zhì)疏松有較好的病理學(xué)改善作用。

    張鵬等[7]針對鐵動態(tài)平衡改變對骨代謝的影響做了實驗性研究,結(jié)果表明不同鐵調(diào)素的干預(yù)可引起鈣離子不同熒光強度的反應(yīng),隨著hFOB1.10外鐵調(diào)素濃度的增加,鈣離子更大量的向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運,而hFOB1.10外鐵離子濃度的下降能夠促進(jìn)鈣離子轉(zhuǎn)運至細(xì)胞內(nèi),說明通過鐵調(diào)素降低鐵離子的含量,可促進(jìn)成骨細(xì)胞對鈣的吸收。劉樹欣等[8]的報道則對細(xì)胞鐵代謝相關(guān)性的研究進(jìn)展進(jìn)行了概述與總結(jié),文章指出,鐵調(diào)素已被證實對于十二指腸的鐵吸收、控制組織細(xì)胞內(nèi)的鐵穩(wěn)定和促進(jìn)巨噬細(xì)胞內(nèi)的鐵釋放有較好作用。趙東陽等[9]的研究提示鐵調(diào)素的干預(yù)對細(xì)胞內(nèi)鐵離子含量有明顯影響,且其影響在0~100 nmol/L的范圍內(nèi)有明顯的劑量依賴性。

    本研究主要從骨科角度對鐵調(diào)素與成骨細(xì)胞相關(guān)性進(jìn)行了實驗研究,并細(xì)致的將成骨細(xì)胞化分為增殖、凋亡、鈣化三個階段,結(jié)果表明,鐵調(diào)素的干預(yù)對于成骨的增殖無顯著影響,但對其凋亡和鈣化作用明顯。隨著鐵調(diào)素用量的增加,成骨細(xì)胞凋亡率明顯降低,而鈣化計數(shù)明顯增高,提示鐵調(diào)素對于促進(jìn)骨質(zhì)內(nèi)部的鈣吸收、減少骨細(xì)胞損傷和凋亡具有重要的促進(jìn)作用。骨質(zhì)疏松已經(jīng)成為嚴(yán)重危害老年人健康與生活質(zhì)量的常見疾病[10],由于其發(fā)展緩慢,不易迅速表現(xiàn)為明顯的體征而被患者關(guān)注。臨床對骨質(zhì)疏松的治療應(yīng)從病理學(xué)角度增強患者的骨能量,促進(jìn)骨鈣的吸收,使骨密度逐漸提升并獲得較好的細(xì)胞營養(yǎng)作用。鈣化能力的增強及凋亡的減少,是成骨細(xì)胞生長和改善患者骨質(zhì)狀況的必要條件,從而減輕老年骨質(zhì)疏松患者的痛苦,提高生活質(zhì)量,延長壽命??傊?,鐵調(diào)素對于成骨細(xì)胞有著較好的促生長作用,能夠有效調(diào)節(jié)人體內(nèi)鐵元素環(huán)境,對于進(jìn)一步研究骨質(zhì)疏松的防治具有重要參考價值。

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