吳之浩
(義烏市中心醫(yī)院 普外一科, 浙江 金華 322000)
低氧是實體瘤局部微環(huán)境的特征之一。低氧時,腫瘤細胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為改變:糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強,對化療藥物產(chǎn)生耐藥性,對放化療不敏感等[1]。前期研究發(fā)現(xiàn),低氧應(yīng)激促進人HepG-2細胞黏附、侵襲和遷移[2]。本研究模擬肝癌低氧微環(huán)境,探討低氧應(yīng)激對人HepG-2細胞甲胎蛋白(AFP)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMP)-1、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)-9表達的影響。
1.1 細胞株和主要試劑 人肝癌細胞株HepG-2引自蘭州軍區(qū)總醫(yī)院實驗科(來源于美國國立腫瘤研究所), 胎牛血清為杭州四季青生物工程公司產(chǎn)品,RT-PCR Kit 購于Takara公司,Trizol為Invitrogen公司產(chǎn)品。MMP-9、TIMP-1、VEGF ELISA試劑盒、AFP放射免疫試劑盒由上海生物制品研究所提供。
1.2 體外細胞培養(yǎng)及實驗分組 HepG-2細胞置滅活10%胎牛血清、100 U/mL青霉素和100μg/mL鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液,于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每3~5天傳代一次。低氧組HepG-2細胞置37 ℃、5% O2、5% CO2、90% N2三氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。
1.3 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達量的測定 Trizol一步法提取細胞總RNA,電泳見28 s、18 s條帶,以2.5μg總RNA為模板,以Takara公司的Random premier為引物進行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA。根據(jù)Genebank中人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin mRNA序列,用primer premier5.0計算機軟件設(shè)計引物(引物由Invitrogen公司合成,引物序列見表1)。優(yōu)化PCR反應(yīng)條件,分別進行AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9與β-actin共擴增,PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠電泳后凝膠成像儀攝片,用IamgeMaster Total v1.01軟件半定量分析各條帶面積,計算各目的基因與內(nèi)參照β-ac-tin的光密度比值表示各目的基因的mRNA表達量。
表1 人AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9及β-actin引物設(shè)計
1.4 HepG-2細胞培養(yǎng)上清AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9含量的測定 取處于對數(shù)生長期的HepG-2細胞,按每孔1×105個細胞接種于24孔培養(yǎng)板,常氧、低氧組HepG-2細胞于常氧、低氧培養(yǎng)24 h;吸取細胞培養(yǎng)上清經(jīng)1000 r/min離心15 min,取上清;放射免疫測定法測定AFP,酶聯(lián)免疫吸附法測定VEGF、TIMP-1、MMP-9含量,均嚴格按試劑盒說明操作。
1.5 統(tǒng)計學(xué)處理方法 應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析,計量資料用±s表示,兩樣本均數(shù)比較采用t檢驗。
2.1 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達 常氧、低氧組總RNA的28 s和18 s條帶比值為2:1,表明所提取的總RNA完整性好,可用于RT-PCR實驗。圖1和表2顯示:低氧組AFP、VEGF、MMP-9蛋白及mRNA的表達顯著高于常氧組,TIMP-1蛋白及mRNA的表達顯著低于常氧組(均P<0.01)。
圖1 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9 mRNA表達
表2 各組人HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達(n=8±s)
表2 各組人HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的表達(n=8±s)
與常氧組比:aP<0.01
)常氧組 0.33±0.06144.68±7.30 0.42±0.0526.17±3.38 0.58±0.06 51.45±6.83 0.30±0.0466.24±4.20低氧組 0.57±0.05a187.93±5.60a0.59±0.06a52.70±4.03a0.29±0.04a30.44±7.12a 0.50±0.05a89.76±4.62a
2.2 HepG-2細胞AFP、VEGF、TIMP-1、MMP-9蛋白及mRNA的相關(guān)性 VEGF mRNA與AFP、MMP-9 mRNA呈正相關(guān)(r=0.820、0.878,P<0.01),與TIMP-1 mRNA呈負相關(guān)(r=-0.880,P<0.01);AFP mRNA與MMP-9 mRNA呈正相關(guān)(r=0.830,P<0.01),與TIMP-1 mRNA呈負相關(guān)(r=-0.722,P<0.01);MMP-9 mRNA與TIMP-1 mRNA呈負相關(guān)(r=-0.835,P<0.01);VEGF蛋白與AFP、MMP-9蛋白呈正相關(guān)(r=0.923、0.876,P<0.01),與TIMP-1蛋白負相關(guān)(r=-0.771,P<0.01),AFP蛋白與MMP-9蛋白呈正相關(guān)(r=0.917,P<0.01),與TIMP-1蛋白負相關(guān)(r=-0.848,P<0.01),MMP-9蛋白與TIMP-1蛋白負相關(guān)(r=-0.863,P<0.01)。
低氧是實體瘤局部微環(huán)境的特征之一。低氧時低氧誘導(dǎo)因子(hypoxia inducible factor,HIF)-1α基因表達上調(diào),轉(zhuǎn)位到細胞核內(nèi)與HIF-1β形成異二聚體HIF-1。HIF-1與靶基因的啟動子或增強子上的低氧反應(yīng)元件(hypoxia response element,HRE)5’-ACGTGC-3’結(jié)合,上調(diào)靶基因的表達并介導(dǎo)一系列腫瘤細胞對低氧的反應(yīng),腫瘤細胞發(fā)生惡性生物學(xué)行為改變:糖酵解途徑、增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移能力增強,對化療藥物產(chǎn)生耐藥性,對放化療不敏感等[1]。VEGF[3]、MMP-9[4]是HIF-1的靶基因,啟動子上存在HIF-1結(jié)合位點HRE。VEGF基因表達上調(diào)促進腫瘤血管新生[3],同時也是一種免疫調(diào)節(jié)因子,能夠削弱樹突狀細胞功能而降低宿主的抗腫瘤免疫反應(yīng)[3]。MMP-9(明膠酶B)屬于高度保守的Zn2+依賴的內(nèi)切蛋白水解酶家族,可降解明膠和IV、V、VII、X型基底膜膠原和細胞外基質(zhì),TIMP-1能選擇性結(jié)合MMP-9活性中心的Zn2+,封閉其催化活性,從而特異性地抑制MMP-9的活性[5]。通常情況下,組織中MMP-9和TIMP-1之間保持著相對平衡狀態(tài),它們的平衡和相互影響決定著細胞基質(zhì)是降解還是聚集和腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移的能力[6]。本實驗顯示:低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細胞VEGF基因的表達,與文獻[1]研究結(jié)果一致;上調(diào)MMP-9基因的表達,與文獻[4]研究結(jié)果一致;下調(diào)TIMP-1基因的表達。低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細胞MMP-9基因的表達、下調(diào)TIMP-1基因的表達,可能是低氧下肝癌細胞侵襲力增強的機制之一。
AFP基因?qū)儆诎椎鞍谆蚣易澹腥齻€增強子,是原發(fā)性肝細胞癌診斷的重要血清標(biāo)記物,參與細胞增殖和代謝的調(diào)節(jié),能促進肝癌細胞增殖[7]。本實驗顯示:低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細胞AFP基因的表達。賀濤等[8]研究提示:沉默AFP基因可抑制肝癌細胞的增殖活性。低氧應(yīng)激上調(diào)HepG-2細胞AFP基因的表達可能是低氧下肝癌細胞增殖活性增強的機制之一。
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