HPLC 法測定丙戊酸血清濃度的衍生化條件考察Δ

毛桂福（柳州市婦幼保健院藥劑科，廣西柳州 545001）

丙戊酸鈉是臨床上常用的抗癲癇藥，監(jiān)測其血藥濃度、實現(xiàn)個體化給藥，可提高癲癇病的控制率[1，2]和減少不良反應(yīng)。衍生化-高效液相色譜（HPLC）法[3～7]是目前國內(nèi)常用的丙戊酸血藥濃度測定方法，但很少文獻(xiàn)[3]對衍生條件進(jìn)行考察。為此，本文以α-溴苯乙酮為衍生化試劑，采用單因素法考察丙戊酸的衍生化條件，并建立穩(wěn)定的衍生化-HPLC法測定丙戊酸血藥濃度。

1 儀器與試劑

1.1 儀器

LC-20AT四元梯度高效液相色譜系統(tǒng)，包括LC-20AT泵、Rheodyne7725i型進(jìn)樣閥、SPD-20A紫外檢測器、CTO-20A柱溫箱、DGU-20A在線脫氣機（日本島津公司）；Hangping FA1004電子分析天平（上海天平儀器廠）；XW-80渦旋混合器（上海醫(yī)科大學(xué)實驗儀器廠）；80-2S臺式低速離心機（上海醫(yī)療器械（集團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠）；L-128氮吹儀（北京來亨科學(xué)儀器公司）。

1.2 試劑

丙戊酸鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：100963-201101，含量：94.5%）；環(huán)己烷羧酸（梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司，批號：FAZ02-GJIR，含量＞95.0%）；α-溴苯乙酮（美國A lfa Aesar公司，批號：10148286，含量：98%）；甲醇、乙腈為色譜純，無水乙醇和乙醚等均為國產(chǎn)分析純；試驗用水為雙重蒸餾水。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Shim-pack CLC-C18（150 mm×4.6 mm，5μm），Shim-pack CLC-C18保護(hù)柱（10mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-乙醇-水（66∶10∶24）；流速：1.0m L·min－1；柱溫：30℃；紫外檢測波長：248 nm；靈敏度：1.00AUFS；進(jìn)樣量：20μL。

2.2 對照品溶液的配制

準(zhǔn)確稱取57.8mg丙戊酸鈉對照品至25m L量瓶中，用0.2mol·L－1氨水溶解并定容，得到濃度為2.01mg·m L－1的丙戊酸貯備液，置冰箱4℃保存，臨用時用水稀釋成不同濃度的對照溶液。另準(zhǔn)確稱取環(huán)己烷羧酸26.3mg至25m L量瓶中，用0.2mol·L－1氨水溶解并定容至刻度，再取該液1.0m L至10 m L量瓶中，用水定容至刻度即得0.1mg·m L－1的內(nèi)標(biāo)溶液。

2.3 血樣處理

精密取血清0.1m L，加入內(nèi)標(biāo)溶液50μL，再加1mol·L－1硫酸150μL，混勻；加入乙醚2m L渦旋提取1min，離心（3 500 r·min－1）10min，吸取上清液至離心管中；加入20%三乙胺乙腈溶液和4mg·m L－1α-溴苯乙酮乙腈溶液各100μL，渦旋混勻，在55℃水浴反應(yīng)20～45min；氮氣吹干，殘渣用甲醇100 μL溶解，旋渦振蕩30 s。

2.4 色譜分離情況

在本試驗條件下，以5人份的混合空白血清、空白血清加對照品與內(nèi)標(biāo)、癲癇患兒服藥后的血清加內(nèi)標(biāo)，按“2.3”項下方法處理后測定，得到色譜圖見圖1。

從圖1可見，丙戊酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物分離良好，血清中無明顯內(nèi)源性雜質(zhì)干擾峰，表明本法有較強的專屬性。內(nèi)標(biāo)及丙戊酸的衍生物保留時間分別為5.55、8.85min。

2.5 丙戊酸衍生化影響因素的考察

2.5.1 衍生化試劑用量：準(zhǔn)確稱取α-溴苯乙酮0.526 g，置25m L棕色量瓶中，用乙腈溶解并稀釋至刻度，即得20.0mg·m L－1的衍生劑貯備液。精密移取適量衍生化試劑貯備液置10m L量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，配制成濃度分別為1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、12.0、16.0mg·m L－1的衍生化試劑溶液。另配制濃度分別為100.4μg·m L－1和200.7μg·m L－1的丙戊酸鈉對照品血清，精密取對照品血清0.1m L，按“2.3”項下方法處理，分別測定在上述7種不同濃度衍生化試劑衍生化反應(yīng)時丙戊酸衍生物的峰面積，以最大的峰面積為100%產(chǎn)率，計算其他條件下丙戊酸衍生物的產(chǎn)率，結(jié)果見圖2。

圖1 高效液相色譜圖A.混合空白血清；B.空白血清+丙戊酸鈉對照品+內(nèi)標(biāo)；C.患者服藥后的血清+內(nèi)標(biāo)；1.環(huán)己烷羧酸（內(nèi)標(biāo)）衍生物；2.丙戊酸衍生物Fig 1 HPLC chromatogram sA.mixed blank serum；B.blank serum+valproic acid control+internql standard；C.serum sample after oral administration+internal standard；1.derivateof cyclohexanecarboxylic acid（IS）；2.derivateof valproic acid

圖2 不同衍生化試劑用量對不同濃度血樣衍生化反應(yīng)的影響Fig 2 Effects of different amount of derivative agent on derivatization for different concentration of blood samp le

由圖2可見，衍生化試劑用量＞400μg后，中、高濃度血樣的衍生物產(chǎn)率都大于95%，波動幅度不大。從衍生化反應(yīng)程度、測定的重復(fù)性及色譜分離等方面綜合考慮，α-溴苯乙酮用量選擇400～600μg為宜。

2.5.2 三乙胺用量：精密移取不同體積的三乙胺至5個10m L的量瓶中，用乙腈定容至刻度，分別配制成濃度為10%、20%、30%、40%、60%的三乙胺溶液。精密量取200.7μg·m L－1丙戊酸對照品血清0.1m L，按“2.3”項下方法處理（衍生化試劑用量為400μg或600μg），分別測定在上述5種不同濃度的三乙胺溶液作催化劑時丙戊酸衍生物的峰面積，計算丙戊酸衍生物的產(chǎn)率。結(jié)果見圖3。

由圖3可見，當(dāng)衍生化試劑用量較大（≥600μg）時，三乙胺用量對衍生化反應(yīng)影響不大；但衍生化試劑用量較小（≤400μg）時，三乙胺用量對衍生化反應(yīng)影響很大。因此，當(dāng)α-溴苯乙酮用量為400～600μg時，三乙胺用量以10～20μL為宜。

2.5.3 反應(yīng)時間與溫度：分別精密量取100.4μg·m L－1丙戊酸對照品血清0.1m L，按“2.3”項下方法操作，分別測定在溫度45、50、55、60℃條件下反應(yīng)10、20、30、40、60min時丙戊酸衍生物的峰面積，計算丙戊酸衍生物的產(chǎn)率。結(jié)果見圖4。

由圖4可見，水浴溫度＞50℃時，反應(yīng)10～60min，衍生化比較完全，產(chǎn)率基本無明顯變化；但水浴溫度為45℃時，反應(yīng)10min時衍生物產(chǎn)率只有76%左右，需20min才能完全衍生化?？紤]到提取溶劑乙醚沸點及操作的方便性，故選擇在55℃水浴中反應(yīng)20～45min。

圖3 不同三乙胺用量對衍生反應(yīng)的影響Fig 3 Effects of different amount of triethylamine on de-

圖4 不同溫度、時間對衍生反應(yīng)的影響Fig 4 Effects of different temperature and time on derivatization

2.6 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

取空白血清0.1m L，精密加入50μL不同濃度的丙戊酸對照品溶液，使其濃度分別為5.0、10.0、20.1、40.1、60.2、100.4、150.5、200.7μg·m L－1，按“2.3”項下方法進(jìn)行操作，記錄色譜。以丙戊酸與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積之比（Y）為縱坐標(biāo)，丙戊酸濃度（X）為橫坐標(biāo)，用加權(quán)最小二乘法進(jìn)行線性回歸（W＝1/C），得回歸方程：Y＝0.017 2X+0.011 4（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，丙戊酸血藥濃度在5.0～200.7μg·m L－1范圍內(nèi)呈良好線性關(guān)系，其最低定量濃度為2μg·m L－1（RSD≤5.6%，n＝6）。

2.7 方法回收率及精密度試驗

取空白血清0.1m L，制備低、中、高3種濃度的丙戊酸血清樣品，按“2.3”項下方法處理后測定，當(dāng)日內(nèi)測定6次，以及1周內(nèi)測定6次，考察方法的精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表1。

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（±s ，n＝6）Tab 1 Resultsof recovery and precision test（s±s ，n＝6）

表1 回收率及精密度試驗結(jié)果（±s ，n＝6）Tab 1 Resultsof recovery and precision test（s±s ，n＝6）

加入量/μg·mL-1 20.1 60.2 150.5日內(nèi)精密度測得量/μg·mL-1 20.19±0.52 60.08±0.94 150.92±1.96平均回收率/%100.43±2.58 99.80±1.57 100.28±1.30 RSD/%2.57 1.57 1.30日間精密度測得量/μg·mL-1 20.01±0.69 59.67±2.68 149.05±3.72平均回收率/%99.57±3.44 99.14±4.45 99.89±2.50 RSD/%3.34 4.45 2.50

2.8 衍生物的穩(wěn)定性

制備低、中、高3種濃度的丙戊酸血清樣品，按“2.3”項下方法處理后，密封，室溫放置。以0 h時測定值為100%，分別放置8、16、30 h時進(jìn)樣測定。結(jié)果含量分別為（98.9±3.2）%、（98.8±2.5）%和（99.7±3.6）%，表明丙戊酸衍生物在室溫放置30 h是穩(wěn)定的。

2.9 臨床應(yīng)用

22名服用丙戊酸鈉的癲癇患兒，年齡6個月～16歲，服藥劑量15～50mg·kg－1·d－1，用本方法監(jiān)測穩(wěn)態(tài)谷濃度。結(jié)果在治療窗（50～100μg·m L－1）之內(nèi)10例，低于治療窗12例。

3 討論

文獻(xiàn)報道的HPLC法[4～7]多采用α-溴苯乙酮作衍生化試劑，其衍生化條件很不一致，如α-溴苯乙酮用量、反應(yīng)溫度和時間分別在100～200μg、45～65℃和10～60min范圍內(nèi)不等。本試驗結(jié)果表明，衍生化試劑用量為200μg時，對高濃度的丙戊酸血樣（200.7μg·m L－1），衍生化程度只有82%左右；在45℃溫度下反應(yīng)10min，衍生物產(chǎn)率只有76%左右。衍生化不完全，易導(dǎo)致測定誤差。

本試驗發(fā)現(xiàn)，丙戊酸與α-溴苯乙酮的衍生反應(yīng)受到衍生劑用量、三乙胺用量、反應(yīng)時間和溫度等條件的影響，其中衍生化試劑用量影響最大。衍生化試劑用量、三乙胺用量、反應(yīng)時間和溫度可選擇的范圍分別為400～600μg、10～20μL、45～60℃和20～60min，在這些條件下丙戊酸衍生化程度達(dá)到97%以上。在此基礎(chǔ)上建立的HPLC法具有線性范圍寬、靈敏度高、重復(fù)性好等優(yōu)點，適用于常規(guī)血藥濃度監(jiān)測和藥動學(xué)研究。

在甲醇-水二元流動相中，加入一定量的乙醇，可以縮短丙戊酸衍生物保留時間，提高分析效率。某些國產(chǎn)的乙醚酸性雜質(zhì)較多，能消耗部分衍生劑而降低衍生物產(chǎn)率，可以用4 mol·L－1氫氧化鈉溶液預(yù)處理除去酸性雜質(zhì)。

[1]宋戰(zhàn)義，陳慶麗.丙戊酸鈉規(guī)范化治療癲癇兒童的臨床研究[J].醫(yī)學(xué)理論與實踐，2010，23（4）：411.

[2]史昆鵬，李曉晶，李曉麗.丙戊酸鈉血藥濃度監(jiān)測對指導(dǎo)兒童癲癇病治療的臨床意義[J].吉林醫(yī)學(xué)，2008，29（23）：2 201.

[3]周莉華，涂 瓊，梅步云.HPLC法測定人血清中丙戊酸鈉的濃度[J].中國藥房，2011，22（26）：2 441.

[4]張志國，雷力力，李 冬，等.HPLC法測定丙戊酸鈉血藥濃度的衍生化影響因素考察[J].中國藥房，2010，21（34）：3 204.

[5]AntunesMV，Nagel V，Linden R，etal.Determination of valproic acid in serum by high performance liquid chromatography with diode array detection（HPLC-DAD），after derivatization with phenacyl bromide[J].Quim Nava，2009，32（5）：1 227.

[6]付翠香，王 軍，鄭京勝.柱前衍生HPLC法測定丙戊酸鈉的血藥濃度[J].海峽藥學(xué)，2008，20（9）：110.