四氧嘧啶腹腔注射致小鼠糖尿病模型因素考察

黃桂紅，鄧 航，李 江，付 翔，羅昱瀾，鄒 勇

桂林醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科，廣西 桂林 541001

隨著糖尿病發(fā)病率逐年增加，治療糖尿病的藥物研究隨之增多。在糖尿病研究中，實(shí)驗(yàn)性糖尿病動(dòng)物模型成功建立與否是研究成敗的關(guān)鍵[1]。這不僅對(duì)研究糖尿病的病因和發(fā)病機(jī)制有重要意義，而且對(duì)于篩選降血糖藥以及研究此類(lèi)藥物的作用機(jī)制有著直接的影響。因此，建立理想的糖尿病動(dòng)物模型已成為人類(lèi)對(duì)治療糖尿病藥物醫(yī)學(xué)研究的重要課題[2]。糖尿病動(dòng)物模型很多，包括化學(xué)藥物（四氧嘧啶、鏈脲佐菌素）致糖尿病模型、催肥致糖尿病動(dòng)物模型、中西醫(yī)結(jié)合方法（高脂、高脂+鏈脲佐菌素）致糖尿病動(dòng)物模型等。目前使用最多的是通過(guò)腹腔注射或靜脈注射化學(xué)物質(zhì)（四氧嘧啶、鏈脲佐菌素）兩種途徑獲得[3]。本文就四氧嘧啶腹腔注射致小鼠糖尿病模型的影響因素及實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行探討，了解四氧嘧啶在不同條件致糖尿病模型的穩(wěn)定性，以獲取最佳造模實(shí)驗(yàn)條件，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

昆明種小白鼠（SPF級(jí)），雌雄兼用。由桂林醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)為SCXK桂2007-0001號(hào)。

1.2 儀器與試劑

紫外分光光度計(jì)（英國(guó)Biochrom，型號(hào)：libra S32PC）；高速離心機(jī)（德國(guó) ABBOTT LABORA TORIES，型號(hào)：D-37520）；上海電子天平（上海精科天平廠，型號(hào)：FA2004）。

四氧嘧啶（美國(guó)sigma公司生產(chǎn)）；葡萄糖試劑盒（溫州東甌津瑪生物科技有限公司，批號(hào)：200912001）；生理鹽水（安徽雙鶴藥業(yè)有限責(zé)任公司，批號(hào)：10032030）；檸檬酸（廣東汕頭市西隴化工廠，批號(hào)：0511142）；檸檬酸鈉（廣東汕頭市西隴化工廠，批號(hào)：0511142）。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS 15.0對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計(jì)量資料數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，采用方差分析，多組間兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料以率表示，采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶媒對(duì)小鼠糖尿病模型制備的影響

取健康小鼠60只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成兩組，即1組和2組，每組各30只。小鼠禁食不禁水12 h，采取2%四氧嘧啶（185 mg/kg）一次性腹腔注射，其中，1組四氧嘧啶用冰生理鹽水配制，2組四氧嘧啶用pH 4.5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液配制，均避光，現(xiàn)用現(xiàn)配，冰浴保存。3 d后，禁食不禁水12 h，眼內(nèi)眥取血，測(cè)空腹血糖值（fasting blood glucose，F(xiàn)GB），F(xiàn)GB 高于 11.1 mmol/L 者確定為造模成功，計(jì)算各組成模率，觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況，計(jì)算死亡率。不同溶媒對(duì)造模的影響結(jié)果顯示，不同的溶媒溶解四氧嘧啶對(duì)造模有一定的影響。用緩沖液作溶媒比用生理鹽水作溶媒的成模率明顯增高，差異有高度統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 （P＜0.01），且成模后血糖值較穩(wěn)定。見(jiàn)表1。

表1 不同溶媒小鼠造模結(jié)果比較（，n=30）

表1 不同溶媒小鼠造模結(jié)果比較（，n=30）

注：與造模前血糖比較，*P＜0.01；與 1 組比較，aP＜0.01

1組2組組別 溶媒 造模前血糖值（mmol/L）生理鹽水緩沖液5.78±2.046.07±2.46造模后血糖值（mmol/L）13.76±5.52*46.36±8.22*a成模數(shù)量（只）622a成模率（%）20.0073.33a造模死亡率（%）013.33a

2.2 造模劑量對(duì)小鼠糖尿病模型制備的影響

取健康小鼠120只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)均分為6組，即對(duì)照組、1組、2組、3組、4組和5組，每組各20只。小鼠禁食不禁水12 h，其中，對(duì)照組一次性腹腔注射緩沖液，劑量為10 ml/kg，1～5組采取一次性腹腔注射2%四氧嘧啶（四氧嘧啶溶于0.1 mol/L，pH 4.5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液現(xiàn)配，避光，冰浴保存），給藥劑量分別為180、185、190、195、200 mg/kg。 3 d 后，禁食不禁水 12 h，眼內(nèi)眥取血，測(cè)空腹血糖值，計(jì)算每組成模率，觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況，計(jì)算死亡率。不同劑量對(duì)造模的影響結(jié)果顯示，當(dāng)給藥劑量為180 mg/kg時(shí)，小鼠死亡率較低，但與給藥劑量185 mg/kg的組比較成模率低。隨著四氧嘧啶注射劑量的增加，小鼠成模率降低，因?yàn)樗劳雎试龈?。結(jié)果顯示，當(dāng)給藥劑量為185 mg/kg時(shí)，其成模率可達(dá)76.67%，且死亡率較低，可見(jiàn)185 mg/kg為比較合適的造模劑量。見(jiàn)表2。

表2 不同劑量四氧嘧啶小鼠造模結(jié)果比較（，n=20）

表2 不同劑量四氧嘧啶小鼠造模結(jié)果比較（，n=20）

注：與對(duì)照組比較，*P＜0.01；與 1 組比較，aP＜0.01，AP＜0.05；與 2 組比較，bP＜0.01，BP＜0.05；與 3 組比較，cP＜0.01，CP＜0.05；與 4 組比較，dP＜0.01，DP＜0.05；“-”表示無(wú)數(shù)據(jù)

組別 給藥劑量（mg/kg）造模前血糖值（mmol/L）成模率（%）造模死亡率（%）對(duì)照組1組2組3組4組5組-1801851901952005.23±1.125.93±2.146.31±2.256.15±2.676.07±3.175.96±3.16造模后血糖值（mmol/L）7.53±3.41abcd 41.6±11.18*46.24±12.38*c 38.39±13.38*bd 48.37±5.69*c 56.78±13.91*abcD成模數(shù)量（只）010150abcd 0abcd 76453.33*Bcd 76.67*Acd 36.67*ab 33.33*ab 23.33*abC 9.12*Bcd 13.33*Acd 43.33*abd 67.67*abc 76.67*abcd

2.3 造模次數(shù)對(duì)小鼠糖尿病模型制備的影響

取健康小鼠60只，隨機(jī)分為A、B、C、D 4組。適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，小鼠禁食不禁水12 h，A組在第1天一次性腹腔注射2%四氧嘧啶180 mg/kg（以生理鹽水做溶媒現(xiàn)配，避光，冰浴保存）；B組分別在第1天及第3天各注射一次，共2次；C組分別在第1天、第3天及第6天各注射一次，共3次；D組為對(duì)照組，腹腔注射生理鹽水10 ml/kg。注射完后72 h，禁食不禁水12 h，眼內(nèi)眥取血，測(cè)空腹血糖值，計(jì)算每組成模率，觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況，計(jì)算死亡率。造模次數(shù)對(duì)造模的影響結(jié)果顯示，在生理鹽水做溶媒的條件下，造模次數(shù)增加，各組小鼠成模率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），而死亡率增大，其中C組較A組和B組死亡率均有所上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。小鼠死亡原因可能是多次給藥，使四氧嘧啶在小鼠體內(nèi)蓄積，毒性增加，造成胰島細(xì)胞及肝腎損害加大，從而導(dǎo)致小鼠死亡率增高。由此可見(jiàn)，通過(guò)追加造模劑量不能增加小鼠的成模率，反而增大小鼠的死亡率，故利用四氧嘧啶腹腔注射造小鼠糖尿病模型最好采取一次性腹腔注射。見(jiàn)表3。

表3 造模次數(shù)對(duì)小鼠造模結(jié)果的比較（）

表3 造模次數(shù)對(duì)小鼠造模結(jié)果的比較（）

注：與 D 組比較，*P＜0.05；與 A 組比較 aP＜0.05；與 B 組比較，bP＜0.05

組別 數(shù)量（只）造模后血糖值（mmol/L）成模數(shù)量（只）A組B組C組D組1515151514.17±2.54*11.77±7.92*20.22±5.68*ab 5.38±2.11ab 5650成模率（%）33.33*40.00*33.33*0造模死亡率（%）013.3326.67*ab 0

2.4 性別對(duì)小鼠糖尿病模型制備的影響

取健康小鼠40只，雌雄各半，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，隨機(jī)分成兩組，即雌性組和雄性組，每組各20只。小鼠禁食不禁水12 h，兩組均采取一次性腹腔注射2%四氧嘧啶185 mg/kg（四氧嘧啶溶于0.1 mol/L，pH 4.5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中，現(xiàn)配，避光、冰浴保存）。3 d后，禁食不禁水12 h，眼內(nèi)眥取血，測(cè)空腹血糖值，計(jì)算各組成模率，觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況，計(jì)算死亡率。小鼠性別對(duì)造模的影響結(jié)果顯示，小鼠性別對(duì)造模有一定的影響。兩組間小鼠成模率及死亡率差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中雄性小鼠比雌性小鼠成模率高，且死亡率比雌性小鼠低。可能是因?yàn)榇菩孕∈笊碓蚧蛴捎谄潴w質(zhì)量較雄性小鼠輕，導(dǎo)致其對(duì)高血糖的耐受力差，死亡率增高，故選擇雄性小鼠造模較合適。見(jiàn)表4。

表4 不同性別對(duì)小鼠造模結(jié)果比較（）

表4 不同性別對(duì)小鼠造模結(jié)果比較（）

注：與雄性組比較，*P＜0.05

組別 數(shù)量（只）雄性組雌性組造模后血糖值（mmol/L）202040.24±12.3852.57±13.98*成模數(shù)量（只）148成模率（%）70.0040.00*造模死亡率（%）10.0025.00*

2.5 體質(zhì)量對(duì)小鼠糖尿病模型制備的影響

取健康小鼠40只，雄性，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體質(zhì)量分為兩組，即18～25 g組和28～35 g組，每組各20只。小鼠禁食不禁水12 h，兩組均一次性腹腔注射2%四氧嘧啶185 mg/kg（四氧嘧啶溶于0.1 mol/L，pH 4.5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖液中，現(xiàn)配，避光、冰浴保存）。3 d后，禁食不禁水12 h，眼內(nèi)眥取血，測(cè)空腹血糖值，計(jì)算各組成模率，觀察7 d，統(tǒng)計(jì)各組小鼠死亡情況，計(jì)算死亡率。小鼠體質(zhì)量對(duì)造模條件的影響結(jié)果顯示，體質(zhì)量較大的小鼠成模率較體質(zhì)量較輕的小鼠低，死亡率高，兩組間比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。一般來(lái)說(shuō)體質(zhì)量較大的小鼠周齡較長(zhǎng)，對(duì)高血糖的耐受力較差，因而死亡率較高，而體質(zhì)量較輕的小鼠周齡較小，對(duì)高血糖的耐受力相對(duì)較強(qiáng)些，提示在實(shí)驗(yàn)中宜選擇體質(zhì)量在18～25 g的小鼠較合適。見(jiàn)表5。

表5 不同體質(zhì)量小鼠造模結(jié)果比較（n=20）

3 討論

四氧嘧啶（Alloxan）是一種有效的致高血糖模型的化學(xué)藥物，其作用機(jī)制是利用四氧嘧啶選擇性破壞胰島β細(xì)胞，使胰島素分泌不足而引起高血糖模型。但研究者普遍反映造模的成功率不高，存在小劑量無(wú)效、大劑量致死的現(xiàn)象，且四氧嘧啶致糖尿病模型的穩(wěn)定性受許多因素影響，如給藥劑量、溶媒、造模次數(shù)、體質(zhì)量等，如不能很好地控制這些因素，就會(huì)造成動(dòng)物死亡率、轉(zhuǎn)陰率升高，以致模型的成功率降低，影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可靠性[4]。

本實(shí)驗(yàn)選擇了多種因素來(lái)探討四氧嘧啶致糖尿病小鼠模型的影響。實(shí)驗(yàn)證明，四氧嘧啶由于水溶性不穩(wěn)定，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用，且避光保存在0～4℃環(huán)境中，在30 min內(nèi)注射完，不同溶媒造模的成模率不同，其中以緩沖液做為溶媒可提高糖尿病小鼠的成模率，這可能是因?yàn)榫彌_液有利于藥物的溶解，減少四氧嘧啶的氧化分解，從而使進(jìn)入體內(nèi)的有效藥量增多，另緩沖液還有助于四氧嘧啶在體內(nèi)的吸收，使成模率提高。

造模劑量的大小一直是小鼠造模的關(guān)鍵問(wèn)題，在本實(shí)驗(yàn)中，造模劑量為185 mg/kg時(shí)，成模率最高，死亡率較低，當(dāng)造模劑量不斷增高，小鼠成模后血糖也越高，造模死亡率升高，且生存質(zhì)量較低，這與四氧嘧啶的毒性有關(guān)，因此劑量并非越大越好，本實(shí)驗(yàn)提示小鼠腹腔注射四氧嘧啶造模劑量以185 mg/kg為適宜，且造模以一次性腹腔注射較好，追加給藥并不能使小鼠成模率增加，反而使小鼠死亡率增加，這與文獻(xiàn)報(bào)道的最佳給藥劑量200 mg/kg不太一致[5]。

小鼠的性別及體質(zhì)量同樣對(duì)造模有一定的影響。實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)雄性小鼠成模率高于雌性小鼠，這與文獻(xiàn)報(bào)道的一致[6]?？赡苡捎诖菩孕∈竽褪芰^雄性小鼠差，因此造模后死亡率較雄性高。另外，體質(zhì)量較大的小鼠較體質(zhì)量輕的小鼠造模成模率低，死亡率高，可能是因?yàn)樾∈篌w質(zhì)量大時(shí)其周齡相對(duì)較大，身體功能相對(duì)衰退，對(duì)四氧嘧啶耐受力下降，從而易導(dǎo)致小鼠死亡。

因此，經(jīng)過(guò)篩選，本研究認(rèn)為，選用雄性，體質(zhì)量在18～25 g小鼠，禁食不禁水12 h，2%四氧嘧啶（用pH 4.5的檸檬酸/檸檬酸鈉緩沖對(duì)現(xiàn)配，避光、冰浴保存）以185 mg/kg造模劑量一次性腹腔注射，小鼠成模率最好，且穩(wěn)定性高，值得推廣應(yīng)用。

[1]崔明明,王三艷,周美娥.建立四氧嘧啶糖尿病小鼠模型的研究[J].現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志,2007,16(30):4431-4432.

[2]黃桂紅,陳薇,羅昱瀾.鏈脲佐菌素穩(wěn)定性對(duì)誘導(dǎo)糖尿病小鼠模型的影響[J].華夏醫(yī)學(xué),2009,22(2):201-203.

[3]徐叔云,卞如濂,陳修.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,1994:1274-1275.

[4]陳建國(guó),梅松,付穎,等.四氧嘧啶致小鼠高血糖模型的研究[J].衛(wèi)生毒理學(xué)雜志,2004,18(2):98-100.

[5]樊志奇,楊勇,容蓉,等.四氧嘧啶制備糖尿病小鼠模型的影響因素研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥,2010,21(8):1948-1949.

[6]楊明華,楊蘇蓓,柴可夫,等.四氧嘧啶致小鼠糖尿病造模條件優(yōu)化及穩(wěn)定性考察[J].中藥藥理與臨床2007,23(5):213-216.