E.coli DH10B堿性磷酸酶基因的克隆、表達(dá)及活性研究

李 軍 ，黃 霞 ，姚雪梅 ，陳雪芬 ，齊興柱

1.熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南海口 570228；2.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南海口 570228

E.coli DH10B堿性磷酸酶基因的克隆、表達(dá)及活性研究

李 軍1,2，黃 霞2，姚雪梅2，陳雪芬2，齊興柱2

1.熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，海南?？?570228；2.海南大學(xué)海洋學(xué)院，海南?？?570228

目的：克隆并表達(dá)E.coli DH10B堿性磷酸酶（AKP）成熟肽基因（phoAm），為AKP的定向改構(gòu)及應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。方法：采用PCR法從E.coli DH10B基因組擴(kuò)增phoAm；將phoAm克隆入表達(dá)載體pET28a，再轉(zhuǎn)入E.coli BL21（DE3）進(jìn)行表達(dá)；用免疫金層析法和SDS-PAGE法檢測(cè)表達(dá)的重組rAKP；采用對(duì)硝基酚磷酸（pNPP）法測(cè)定rAKP的活性。結(jié)果：rAKP單體分子量約47 K，活性分析比對(duì)照菌提高21.5倍。結(jié)論：獲得AKP成熟肽基因并得了到具有較高活性的重組rAKP。

堿性磷酸酶；大腸桿菌DH10B；表達(dá)純化；活性分析

堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，AKP）是一類非特異性磷酸單酯酶，可催化磷酸單酯的水解[1]。AKP廣泛存在于多種細(xì)菌、真菌和動(dòng)物中。不同來源的AKP的相對(duì)分子質(zhì)量和編碼序列差異很大，且各種AKP的性質(zhì)、結(jié)構(gòu)、功能和催化機(jī)制也不完全相同。其中，E.coli AKP由phoA基因編碼，為同源二聚體金屬酶，單體由449個(gè)氨基酸組成，相對(duì)分子質(zhì)量為47 K，活性中心包括3個(gè)金屬原子，即2個(gè)鋅原子和1個(gè)鎂原子[2]。

E.coli AKP催化機(jī)制明確，底物范圍廣泛，作為工具酶在表位連鎖、組織化學(xué)、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應(yīng)用。E.coli DH10B無致病性和耐藥基因，是基因克隆的常用受體菌。本研究首次從E.coli DH10B基因組中克隆了AKP的成熟肽基因（phoAm）并進(jìn)行了表達(dá)研究，從而為此種酶的結(jié)構(gòu)、功能和應(yīng)用研究打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株、載體 大腸桿菌菌株E.coliDH10B、E.coliBL21（DE3）、E.coli DH5α及原核表達(dá)載體pET28a（+）由熱帶生物資源教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑 T4 DNA連接酶、限制性核酸內(nèi)切酶BamHⅠ、HindⅢ、氨芐青霉素、卡那霉素、異丙基硫代-β-D-半乳糖苷（IPTG）、對(duì)硝基苯磷酸（pNPP）購自生工生物（上海）有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA產(chǎn)物純化試劑盒、Pfu DNA聚合酶購自天根生化科技（北京）有限公司。His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、重組標(biāo)簽蛋白快速檢測(cè)試劑盒GoldCassette-HIS購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 引物 引物設(shè)計(jì)后由生工生物（上海）有限公司合成。

1.1.4 儀器 UV-2450紫外可見分光光度計(jì)（島津）；超微量黑色石英比色皿（島津）；PCR擴(kuò)增儀（2720 Thermal Cycler Applied Biosystems）；凝膠成像系統(tǒng)（BioRad）。

1.2 方法

1.2.1 E.coli DH10B基因組DNA的提取與純化 E.coli DH10B甘油菌經(jīng)LB培養(yǎng)液增菌培養(yǎng)后，用天根公司的細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒進(jìn)行提取與純化。提取的基因組DNA用紫外分光光度法進(jìn)行評(píng)價(jià)。

1.2.2 引物設(shè)計(jì) 從Genbank數(shù)據(jù)庫下載E.coli DH10B的phoA 基因序列（accession number：NC-010473），使用 Primer Premier 6.0和Oligo 7.37輔助設(shè)計(jì)用于擴(kuò)增AKP phoAm的引物，為便于克隆進(jìn)表達(dá)載體pET28a中，在引物兩端加上適當(dāng)?shù)拿盖形稽c(diǎn)和保護(hù)堿基。設(shè)計(jì)的引物如下，正向引物（phoAm-F）：5'-GTCATGGATCCCGGACACCAGAAATGCC-3'（BamHⅠ）；反向引物（phoAm-R）：5'-GCGACAAGCTTTATT TCAGCCCCAGAGC-3'（HindⅢ）。

1.2.3 PCR法擴(kuò)增phoA基因 在0.2 ml PCR管內(nèi)配制50 μl反應(yīng)體系，按下述程序進(jìn)行PCR擴(kuò)增：94℃預(yù)變性3 min；擴(kuò)增 30個(gè)循環(huán)， 即 94℃ 30 s→55℃ 30 s→72℃ 2 min；72℃延伸5 min。反應(yīng)結(jié)束后，0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)并進(jìn)行測(cè)序。

1.2.4 phoAm基因的克隆 PCR產(chǎn)物經(jīng)DNA產(chǎn)物純化試劑盒純化后，用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ雙酶切，并與同樣經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切的表達(dá)載體pET28a（+）經(jīng)T4 DNA連接酶連接后，轉(zhuǎn)化E.coli BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)LB/kan篩選平板培養(yǎng)后，用菌落PCR鑒定轉(zhuǎn)化子。

1.2.5 phoAm基因的誘導(dǎo)表達(dá) 分別接種pET28a-phoAm/BL21（DE3）和 pET28a/BL21（DE3）單菌落至 5 ml LB 培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜。按1%的比例接種陽性菌液至100 ml LB培養(yǎng)液中，37℃振蕩培養(yǎng)，至菌液OD600nm約為0.4時(shí)，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)，繼續(xù)培養(yǎng)3 h。

1.2.6 重組蛋白（rAKP）的檢測(cè) 菌體離心后，加入緩沖液超聲破碎，離心取上清液，用免疫金層析法檢測(cè)6×His標(biāo)簽，用SDS-PAGE法檢測(cè)表達(dá)蛋白。

1.2.7 重組蛋白（rAKP）的純化 采用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行純化。對(duì)洗脫液進(jìn)行SDS-PAGE分析并用Bradford法定量。

1.2.8 重組蛋白（rAKP）的活性分析 采用對(duì)硝基酚磷酸（pNPP）法測(cè)定rAKP的活性。取發(fā)酵菌體超聲破碎后的上清液，加入測(cè)活液，30℃反應(yīng)10 min，加入終止液終止反應(yīng)，于波長410 nm處測(cè)吸收值。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴(kuò)增E.coli DH10B成熟肽基因（phoA）

PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠電泳上分析，可見1.4 kb的條帶（圖1）大小與預(yù)期一致。

圖1 E.coli DH10B phoAm PCR產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳

2.2 重組蛋白（rAKP）的表達(dá)與檢測(cè)

重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，取超聲破碎后的上清液，分別用免疫金層析法快速檢測(cè)6×His標(biāo)簽（圖2），用SDS-PAGE法檢測(cè)表達(dá)蛋白（圖3）。rAKP的分子量約為47 K。

圖2 免疫金層析法快速檢測(cè)His標(biāo)簽蛋白

圖3 SDS-PAGE檢測(cè)誘導(dǎo)表達(dá)的rAKP

2.3 重組蛋白（rAKP）的活性分析

rAKP經(jīng)活性分析，對(duì)照菌 E.coli BL21（DE3）的 OD405nm為 0.120，重組菌 E.coli BL21（DE3）/phoAm 的 OD405nm為2.58，即重組菌的堿性磷酸酶活性提高21.5倍。

3 討論

本研究首次從E.coli DH10B菌株的基因組中克隆了堿性磷酸酶成熟肽基因，并進(jìn)行了表達(dá)、純化與活性研究。E.coli AKP作為工具酶在表位連鎖、組織化學(xué)、免疫印跡、突變分析等方面有廣泛應(yīng)用。目前市場(chǎng)上常見的AKP產(chǎn)品有蝦堿性磷酸酶（SAP）和牛小腸堿性磷酸酶（CIAP），其中CIAP的活性最高，約為天然E.coli AKP的40倍[3]。與天然提純的SAP和CIAP相比，E.coli AKP的生產(chǎn)成本低，熱穩(wěn)定性好。由于AKP的構(gòu)效關(guān)系明確，且在定點(diǎn)誘變和結(jié)構(gòu)改造方面積累了一定的經(jīng)驗(yàn)[4-5]。進(jìn)一步研究可結(jié)合計(jì)算機(jī)模擬對(duì)E.coli AKP的三維結(jié)構(gòu)與催化活性之間的關(guān)系進(jìn)行深入分析[6]，利用當(dāng)前蛋白質(zhì)工程的先進(jìn)技術(shù)手段對(duì)重組E.coli AKP進(jìn)一步改構(gòu)。

[1]Coleman JE,Gettins P.Alkaline phosphatase,solution structure,and mechanism[J].Adv Enzymol Relat Areas Mol Biol,1983,55:381-452.

[2]Coleman JE.Structure and mechanism of alkaline phosphatase[J].Annu Rev Biophys Biomol Struct,1992,9(21):441-483.

[3]Wanner BL.Overlapping and separate control on the phosphateregulation in E.coli K12[J].J Mol Biol,1983,166:283-308.

[4]MullerBH,LamoureC,LeD.ImprovingEscherichiacolialkalinephosphatase efficacy by additional mutations inside and outside the catalytic pocket[J].Chembiochem,2001,(2):517-523.

[5]王秋穎,李寧,向本瓊.大腸桿菌堿性磷酸酶突變體的構(gòu)建及其結(jié)構(gòu)與功能研究[J].北京師范大學(xué)學(xué)報(bào):自然科學(xué)版,2007,43(6):647-652.

[6]Lopez-CanutV,RocaM,BertranJ,etal.Promiscuityinalkalinephosphatase superfamily,unraveling evolution through molecular simulations [J].J Am Chem Soc,2011,133(31):12050-12062.

Study on cloning,expression and activity of alkaline phosphatase from Escherichia coli DH10B

LI Jun1,2,HUANG Xia2,YAO Xuemei2,CHEN Xuefen2,QI Xingzhu2
1.Key Laboratory of Tropical Biological Resources of Ministry of Education,Hainan Province,Haikou 570228,China;2.Ocean College of Hainan University,Hainan Province,Haikou 570228,China

Objective:To clone and express alkaline phosphatase mature peptide gene of E.coli DH10B for the foundation of directed structural transformation and application of AKP.Methods:phoAm gene was amplified from E.coli DH10B genome by PCR;phoAm gene was cloned into pET28a and transformed into E.coli BL21(DE3);rAKP was detected by immuno-gold chromatography and SDS-PAGE;the activity of rAKP was determined by pNPP method.Results:Molecular weight of rAKP monomer was about 47 K,and activity of rAKP increased 21.5 times compared with the control.Conclusion:AKP matural peptide gene and rAKP with higher activity is acquired.

Alkaline phosphatase;E.coli DH10B;Express and purify;Activity analysis

Q78

A

1673-7210（2012）01（a）-028-03

海南大學(xué)211工程研究生教育教學(xué)改革研究項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)：YJG0102）。

李軍（1969-），男，博士，副教授，碩士研究生導(dǎo)師；研究方向：生物制藥與藥物制劑。

2011-08-08）