扁平苔蘚中早期生長反應因子-1和腫瘤壞死因子-α的表達及意義

鄧磷君，白 莉

山西醫(yī)科大學第一醫(yī)院皮膚科，山西太原 030001

扁平苔蘚（lichen planus，LP）是一種慢性炎癥性疾病，累及皮膚黏膜，發(fā)病機制尚無定論。近年來研究發(fā)現(xiàn)細胞凋亡在其發(fā)病中有著重要作用。有學者認為腫瘤壞死因子-α（TNF-α）在扁平苔蘚角質形成細胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，國內外研究表明，早期生長反應因子-1（Egr-1）可以上調TNF-α的表達[1-2]。本研究通過檢測Egr-1、TNF-α在扁平苔蘚皮損處的表達，探討它們在扁平苔蘚發(fā)病中的作用。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取在我院皮膚科就診的30例患者，均經(jīng)臨床和病理確診為扁平苔蘚，其中，男18例，女12例；年齡15～70歲，平均41.5歲；半年內未使用過激素、免疫調節(jié)劑治療。對照組30例均為我院整形科和普外科的正常人，其中，男16例，女14例；年齡22～69歲，平均44歲；無任何皮膚病及系統(tǒng)性疾病。兩組性別和年齡比較差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），具有可比性。所有皮損和正常皮膚組織均經(jīng)甲醛固定石蠟包埋備用。

本課題已經(jīng)倫理委員會討論通過，且所有患者自愿簽署了知情同意書。知情同意書內容主要包括：本課題研究時間為2010年6月～2011年3月；對患者的隱私進行保密；本實驗的研究目的為進一步探討參與LP的發(fā)病原因，為治療該疾病提供有效依據(jù)；如患者受到因本實驗導致的損失，筆者則加以賠償；患者在了解上述內容后自愿填寫同意書。

1.2 試劑

TUNEL原位凋亡檢測試劑盒及二步法PV-6001 免疫組織化學檢測試劑盒購自北京中杉生物技術公司；兔抗人Egr-1多克隆抗體購自北京博奧森生物技術公司；兔抗人TNF-α多克隆抗體由武漢博士德生物技術公司提供。

1.3 方法

1.3.1 TUNEL原位凋亡檢測法 石蠟標本連續(xù)切片；37℃烘烤過夜；常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，加3%的H2O2滅活內源性過氧化物酶，20μg/ml蛋白酶K37℃修復15 min，滴加TdT及FITC標記的核苷酸混合反應液37℃ 75 min，后滴加轉換劑POD液37℃30 min，DAB顯色，蘇木素復染，封片。用不含TdT酶，只含標記dUTP的溶液代替TUNEL反應液作為陰性對照。

1.3.2 免疫組織化學法 采用PV6001 二步法：石蠟標本連續(xù)切片；常規(guī)二甲苯脫蠟；梯度酒精水化；蒸餾水沖洗，加3%的H2O2滅活內源性過氧化物酶；在枸櫞酸鈉緩沖液中高壓加熱（Egr-1 加熱 2 min，TNF-α 加熱 30 s）進行抗原修復；滴加一抗（Egr-1 濃縮液 1∶300 稀釋，TNF-α 濃縮液 1∶200 稀釋）；以PBS代替一抗作為陰性對照，37℃孵育 1 h；滴加二抗PV6001，37℃孵育 15 min，DAB 顯色；蘇木素復染，封片。

1.4 結果判定

TUNEL原位凋亡檢測結果以顯微鏡下細胞核有棕黃色顆粒為陽性。免疫組織化學結果以細胞漿和（或）細胞核有棕黃色顆粒為陽性，每張切片隨機選取5個視野，利用MIAS-2000 圖像分析系統(tǒng)分析陽性區(qū)域積分光密度值（IOD值），以IOD值的大小代表陽性產(chǎn)物表達的多少。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標準差（±s）表示，兩組間比較采用成組t檢驗，指標間相關性采用Pearson相關分析，P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 TUNEL檢測結果

LP皮損表皮中大量角質形成細胞 （尤以液化變性的基底細胞層為多）和真皮淺層浸潤的淋巴細胞呈陽性染色；而正常皮膚組織中僅有個別細胞出現(xiàn)凋亡；陰性對照中未見陽性結果。

2.2 免疫組織化學檢測結果

LP皮損中Egr-1 的陽性表達重要分布于表皮全層的角質形成細胞和真皮淺層浸潤的淋巴細胞核和胞漿中（以胞核為主），TNF-α陽性表達分布于相同部位的細胞漿中；而在正常皮膚組織中均呈陰性或弱陽性表達。兩者在扁平苔蘚組和對照組中的表達差異有統(tǒng)計學意義 （Egr-1：t=6.410，P<0.05；TNF-α：t=7.585，P<0.05），扁平苔蘚組中 Egr-1 和 TNF-α的表達水平呈正相關（r=0.896 7，P<0.05）。見表1。

表1 早期生長反應因子-1、腫瘤壞死因子-α在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達水平（±s，μg/L）

表1 早期生長反應因子-1、腫瘤壞死因子-α在扁平苔蘚和正常皮膚組織中的表達水平（±s，μg/L）

注：與對照組比較，*P<0.05

扁平苔蘚組對照組組別例數(shù)30 30 Egr-1 11.296 ±3.316*7.076 ±1.343 TNF-α 12.996 ±3.761*7.399 ±1.482

3 討論

LP是一種慢性皮膚黏膜疾病，至今發(fā)病機制尚未明確。細胞凋亡在LP發(fā)病中有著十分重要的作用。多項研究指出淋巴細胞參與介導的角質形成細胞過度凋亡可能是導致LP發(fā)病的重要機制，且其皮損中的膠樣小體即為凋亡小體[3]。本研究結果顯示，LP皮損處凋亡細胞數(shù)明顯高于正常皮膚組織，證明了細胞凋亡的異常在LP發(fā)病中的作用有著十分重要的意義。本實驗中凋亡細胞主要分布于表皮基底層和真皮淺層，且在相同部位檢測到Egr-1、TNF-α大量表達，表明Egr-1 和TNF-α可能是通過介導細胞凋亡的發(fā)生參與LP的發(fā)病。

Egr-1 是含有3個鋅指結構的轉錄因子，是即刻反應基因（immediate-early gene）的產(chǎn)物[4]。其基因廣泛存在于從酵母到人類的真核細胞基因庫中，參與調節(jié)多種細胞因子的基因表達。當細胞受到應激、炎癥等細胞外刺激而引起膜去極化時，原本處于休眠狀態(tài)的即刻反應基因通過絲裂原激活蛋白激酶（MAPKs）轉導通路被激活[5]，轉導合成Egr-1 蛋白。 有研究表明，多種細胞因子的編碼基因啟動子中都存在著功能性Egr-1 的結合位點，包括增殖分化、細胞凋亡、炎癥因子趨化等相關基因[6]。Egr-1 通過與基因啟動子上的位點結合，可調控相關細胞因子的表達，參與相應生物學作用的發(fā)生。本研究實驗結果顯示，Egr-1 在LP中的表達明顯高于正常皮膚組織，這與劉麗等[7]的研究結果相一致，由此推測Egr-1 的高表達可能參與LP的發(fā)病。

皮膚中的TNF-α是由單核巨噬細胞、激活的T淋巴細胞和角質形成細胞產(chǎn)生的細胞因子，不僅參與免疫應答和炎癥反應，還可介導細胞凋亡的發(fā)生。本研究結果顯示，LP皮損中TNF-α表達明顯高于正常皮膚組，這與王娟等[8]的研究結果一致，表明TNF-α在基底層和真皮淺層的高表達可能參與了LP的發(fā)病。LP皮損中CD8+T細胞占真皮淺層浸潤的淋巴細胞的絕大多數(shù)，其可在局部釋放細胞因子，通過死亡受體和穿孔素途徑介導角質形成細胞凋亡。目前研究表明，死亡受體途徑可能通過T淋巴細胞分泌的TNF-α、FasL與角質形成細胞表面的TNFR、Fas相結合，激活Caspase酶系的級聯(lián)反應[9]，從而誘導角質形成細胞凋亡。

近年來有研究表明，Egr-1 可以上調TNF-α的表達水平[1]。本研究結果提示，Egr-1 與TNF-α的表達呈正相關，再次證明Egr-1 對TNF-α表達可能有促進作用。因細胞受到胞外刺激而轉錄合成的Egr-1 可能與TNF-α編碼基因啟動子上的位點結合，上調了TNF-α的表達水平。有學者通過利用Egr-1 反義寡核苷酸（AS-ODN）抑制Egr-1 的表達，觀察到大鼠缺氧心肌細胞TNF-α表達明顯減少，證明了Egr-1對TNF-α的可能的誘導作用[2]。

因此筆者認為，Egr-1 可能通過上調TNF-α的表達，經(jīng)由CD8+T細胞介導角質形成細胞凋亡，從而參與了LP的發(fā)病。

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[6] Blaschke F， Bruemmer D， Law RE.Egr-1 is a major vascular pathogenic transcription factor in atherosclerosis and restenosis[J].Rev Endocr Metab Disord,2004,5(3):249-254.

[7] 劉麗，臧磊，呂曉丹,等.Egr-1 在口腔扁平苔蘚及口腔鱗狀細胞癌中的表達及意義[J].寧夏醫(yī)科大學學報,2010,32(2):204-206.

[8] 王娟，白莉.扁平苔蘚中TNF-α和TNFRⅠ的表達及意義[J].實用醫(yī)雜志,2008,15(31):4342-4343.

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