1，25-二羥維生素D3對(duì)大鼠腎間質(zhì)纖維化的作用研究

榮智利，張 旭，張翠薇，高 岑，江 燕，馬躍榮

瀘州醫(yī)學(xué)院病理教研室，四川瀘州 646000

腎間質(zhì)纖維化（renal interstitial fibrosis，RIF）是一個(gè)多步驟、連續(xù)的動(dòng)態(tài)過(guò)程，是各種慢性腎臟疾病發(fā)展至終末期的共同通路和主要病理改變[1]，其變化的程度和范圍決定了腎功能的惡化程度[2-4]。單側(cè)輸尿管梗阻（unilateral ureteral obstruction，UUO）大鼠是一種經(jīng)典的RIF動(dòng)物模型，既可短期內(nèi)致使腎間質(zhì)纖維化，模擬慢性腎病時(shí)腎間質(zhì)的病理表現(xiàn)，又可使病變局限在腎小管和腎間質(zhì)，不引起腎小球及其他組織的損傷[5]。近期研究顯示，1，25-二羥維生素 D3〔1，25-dihydroxyvitamin D3，1，25-（OH）2D3〕 主要通過(guò)與其特異性受體結(jié)合發(fā)揮經(jīng)典的骨鹽調(diào)節(jié)作用，并參與免疫調(diào)節(jié)、調(diào)控激素分泌和細(xì)胞有絲分裂、抑制細(xì)胞增殖、分化及凋亡等過(guò)程[6]。 1，25-（OH）2D3受體可選擇性表達(dá)于腎臟的近曲小管、遠(yuǎn)曲小管、集合管和髓袢升支[7]，但其是否在RIF形成過(guò)程中發(fā)揮作用不詳。本研究利用1，25-（OH）2D3干預(yù)UUO大鼠，觀察其對(duì)RIF形成有無(wú)影響，以探討其在RIF過(guò)程中的作用。

1 儀器與試藥

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性 SD 大鼠，45 只，8 周齡，體重（200±20） g，購(gòu)自瀘州醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 藥物和主要試劑

1，25-（OH）2D3（Roche 公司，美國(guó)），兔抗大鼠 α-SMA 多克隆抗體（Santa Cruz公司，美國(guó)），尿蛋白雙縮脲試劑盒（Amresco公司，美國(guó)）。

2 方法與結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)方法

2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及處置 45只SD大鼠隨機(jī)均分為假手術(shù)組、UUO 組和 1，25-（OH）2D3干預(yù)組，每組各 15只。 采用單側(cè)輸尿管結(jié)扎建立UUO大鼠模型[8]。1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，局部剃毛和常規(guī)消毒鋪巾，選腹正中切口依次切開(kāi)皮膚至腹腔，游離腎臟及輸尿管，分別在左側(cè)輸尿管近腎盂處和輸尿管上1/3處用1-0絲線兩次結(jié)扎，剪斷輸尿管，然后逐層連續(xù)縫合皮膚。假手術(shù)組進(jìn)入腹腔后僅游離腎臟和輸尿管而不結(jié)扎離斷，余手術(shù)方式與UUO組相同。干預(yù)組于術(shù)后第 1天起每天腹腔注射 30 ng/（kg·d）的 1，25-（OH）2D3[9]，假手術(shù)組及UUO組每天腹腔注射等量生理鹽水。分別于術(shù)后第3、7和14天處死大鼠，每次5只，取梗阻側(cè)腎臟測(cè)量其大小及形態(tài)，固定包埋后，制片行HE、Masson和α-SMA染色；開(kāi)胸經(jīng)心臟取血檢測(cè)肌酐和尿素氮水平；各組大鼠于處死前1天收集24 h尿液，檢測(cè)尿蛋白含量。

2.1.2 腎臟病理檢查 每張HE、Masson和α-SMA切片隨機(jī)選取10個(gè)不重復(fù)視野（×200，HPF），組內(nèi)求和取其平均值作為每組最終數(shù)據(jù)。①HE染色判定腎間質(zhì)損傷及纖維化程度：HE切片依據(jù)Radford[10]標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定8個(gè)參數(shù)指標(biāo)（腎小管擴(kuò)張、小管萎縮、小管上皮細(xì)胞空泡變性、間質(zhì)水腫、間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤(rùn)、間質(zhì)纖維化程度、紅細(xì)胞管型、蛋白管型），每個(gè)參數(shù)按0～3分評(píng)定（0分，正常；1分，輕度受損，病變范圍＜15%；2分，中度受損，病變范圍15%～50%；3分，重度受損，病變范圍＞50%），由兩個(gè)觀察者盲法評(píng)分取其平均值，每個(gè)樣本的評(píng)分為0～24分。②Masson染色判定纖維化程度：Masson染色是用于顯示組織中纖維的一種染色方法，染色切片中膠原纖維呈綠色，肌肉、纖維素和紅細(xì)胞均呈紅色，細(xì)胞核呈藍(lán)色，正常腎組織中僅腎小管基底膜染成綠色。RIF進(jìn)程中膠原纖維逐步取代正常腎單位，腎實(shí)質(zhì)萎縮減少。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)膠原纖維染色，運(yùn)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算鏡下綠染面積占整個(gè)視野的百分比，以了解受損腎臟的纖維化程度。③α-SMA免疫組化染色：在本實(shí)驗(yàn)中α-SMA用于標(biāo)記肌成纖維細(xì)胞（myofibroblast，MFB），其陽(yáng)性信號(hào)為細(xì)胞胞漿呈現(xiàn)棕黃色顆粒。運(yùn)用Image Pro Plus 6.0圖像分析軟件計(jì)算染色陽(yáng)性細(xì)胞的積分光密度值（指將陽(yáng)性細(xì)胞內(nèi)染色量化為綜合面積和灰度值所得到的結(jié)果，其值越大，提示抗原表達(dá)水平越高，反之亦然）。

2.1.3 腎功能檢測(cè) 采血后3 000 r/min離心分離血清，于日本7180型全自動(dòng)生化分析儀上檢測(cè)血肌酐、尿素氮水平（此血生化檢查由瀘州醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科協(xié)助完成）；根據(jù)尿蛋白雙縮脲試劑盒的操作說(shuō)明，檢測(cè)24 h尿蛋白含量。

2.1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，所有數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間計(jì)量資料比較用單因素方差分析（One-way ANOVA test），兩兩比較采用 Dunnett-t檢驗(yàn)。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2 腎臟病理學(xué)改變結(jié)果

2.2.1 肉眼病理改變 假手術(shù)組患側(cè)腎臟大小形態(tài)正常；UUO組和干預(yù)組梗阻側(cè)腎臟均明顯腫大，顏色變淺，表面張力增加，有尿液潴留，切面腎實(shí)質(zhì)變薄，腎盂腎盞擴(kuò)張，皮髓質(zhì)分界不清，腎乳頭缺血萎縮，并隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而加重，以UUO組病變更為明顯。

2.2.2 光鏡下病理改變 ①HE切片假手術(shù)組各時(shí)間點(diǎn)腎組織無(wú)明顯改變。UUO組術(shù)后第3天腎小管輕度少量擴(kuò)張，上皮細(xì)胞濁腫變性，腎間質(zhì)輕度水腫，伴炎細(xì)胞局灶性浸潤(rùn)；術(shù)后第7天，腎小管進(jìn)一步擴(kuò)張，以皮髓交界處尤為明顯，上皮細(xì)胞空泡變性，管腔內(nèi)見(jiàn)細(xì)胞或蛋白，伴炎細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)和部分小管間質(zhì)輕度纖維化；術(shù)后第14天，皮髓質(zhì)變薄，小管擴(kuò)張明顯，甚至擴(kuò)張呈囊性，部分管腔塌陷，上皮細(xì)胞空泡變性顯著，出現(xiàn)大量壞死，間質(zhì)內(nèi)巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞彌漫性浸潤(rùn)和成纖維細(xì)胞增生及膠原形成，纖維化明顯，各時(shí)間點(diǎn)腎間質(zhì)評(píng)分差異明顯，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。②Masson切片顯示假手術(shù)組綠染區(qū)域主要位于小管基底膜及其周圍，小管間質(zhì)幾乎無(wú)染色。術(shù)后第3天，UUO組皮髓交界區(qū)出現(xiàn)輕度纖維化，并隨著梗阻時(shí)間的延長(zhǎng)綠染面積擴(kuò)大，表現(xiàn)為腎間質(zhì)進(jìn)行性增寬，膠原纖維增加，染色加深，各時(shí)間點(diǎn)綠染面積所占百分比比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。③假手術(shù)組α-SMA僅表達(dá)于血管平滑肌細(xì)胞，腎小球、腎小管及間質(zhì)均未見(jiàn)表達(dá)。UUO組術(shù)后第3天可見(jiàn)腎間質(zhì)內(nèi)α-SMA少量表達(dá)；術(shù)后第7天腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)陽(yáng)性表達(dá)，皮髓交界處出現(xiàn)輕微纖維化；術(shù)后第14天表達(dá)達(dá)到高峰，皮質(zhì)區(qū)和皮髓交界區(qū)明顯，各時(shí)間點(diǎn)α-SMA的累積光密度值（IOD）比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。④干預(yù)組與假手術(shù)組相比，各時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)明顯增高；而較之UUO組，各時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善，其腎損傷、間質(zhì)纖維化程度及α-SMA陽(yáng)性率明顯改善，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見(jiàn)表1、圖1。

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)光鏡下病理改變（±s，n=5）

表1 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)光鏡下病理改變（±s，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與 UUO 組比較，bP＜0.05；與第 3 天比較，cP＜0.05；與第 7 天比較，dP＜0.05

動(dòng)物處死時(shí)間第3天 第7天 第14天HE腎間質(zhì)損傷評(píng)分（分）Masson綠染面積百分比（%）α-SMA的IOD值檢查指標(biāo) 組別假手術(shù)組UUO組干預(yù)組假手術(shù)組UUO組干預(yù)組假手術(shù)組UUO組干預(yù)組1.20±0.84 4.40±1.14a 2.80±0.85ab 3.21±0.33 5.39±0.61a 3.98±0.14ab 197.65±0.87 433.91±23.08a 325.92±20.28ab 1.20±0.45 13.60±2.51ac 9.60±1.14abc 3.26±0.40 12.14±1.57ac 3.98±0.14abc 199.29±3.26 656.55±23.47ac 461.98±21.93abc 1.00±0.71 19.80±1.48acd 14.20±1.30abcd 3.37±0.47 47.19±2.86acd 31.59±2.36abcd 198.23±1.50 856.00±21.15acd 595.54±6.75abcd

2.3 各組腎功能比較結(jié)果

圖1 各組大鼠第14天腎臟HE、Masson、a-SMA染色比較（×200）

與假手術(shù)組相比，術(shù)后第3、7和14天UUO組與干預(yù)組肌酐、尿素氮及24 h尿蛋白含量均明顯高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05），其中第3、7天各指標(biāo)呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，第14天時(shí)表現(xiàn)為下降；與UUO組相比，干預(yù)組各時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；而假手術(shù)組術(shù)后各時(shí)間點(diǎn)各項(xiàng)指標(biāo)差異不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 見(jiàn)表 2。

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎功能變化（±s，n=5）

表2 各組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)腎功能變化（±s，n=5）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與 UUO 組比較，bP＜0.05

動(dòng)物處死時(shí)間第3天 第7天 第14天血肌酐（μmol/L）尿素氮（mmol/L）24 h尿蛋白（mg/24 h）檢查指標(biāo) 組別假手術(shù)組UUO組干預(yù)組假手術(shù)組UUO組干預(yù)組假手術(shù)組UUO組干預(yù)組36.60±0.99 77.46±0.98a 54.42±0.60ab 4.98±0.29 5.04±0.26 7.34±0.17ab 11.64±0.38 13.00±0.24a 12.52±0.39ab 37.10±0.62 148.48±7.49a 83.10±0.77ab 5.04±0.26 18.16±0.36a 11.22±0.36ab 11.56±0.18 23.56±0.47a 16.98±0.47ab 36.94±0.92 69.82±0.98a 52.36±0.69ab 5.04±0.13 10.02±0.23a 8.96±0.27ab 11.58±0.19 15.94±0.34a 13.48±0.43ab

3 討論

RIF發(fā)生機(jī)制錯(cuò)綜復(fù)雜，可概括為細(xì)胞外基質(zhì)增多、腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化 （epithelial tmesenchymal transition，EMT）和多種細(xì)胞因子及血管活性物質(zhì)的激活與相互作用。近年研究表明，MFB的激活是RIF形成的關(guān)鍵[11]，而其中1/3的MFB由EMT而來(lái)[12]，這種EMT的細(xì)胞過(guò)度增殖，可分泌多種細(xì)胞因子致使細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，最終導(dǎo)致RIF的發(fā)生。RIF的病理過(guò)程是由病變初期的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，繼而EMT發(fā)生和腎間質(zhì)成纖維細(xì)胞活化增殖，共同產(chǎn)生大量細(xì)胞外基質(zhì)并發(fā)生沉積，最后腎小管萎縮消失，小管間質(zhì)纖維化[4]。正常成熟的腎小管上皮細(xì)胞表達(dá)角蛋白，腎間質(zhì)細(xì)胞表達(dá)波形蛋白，均無(wú)α-SMA的表達(dá)；而MFB是成纖維細(xì)胞的活化形式，胞漿內(nèi)含肌動(dòng)蛋白，可表達(dá)α-SMA。MFB廣泛存在于纖維化腎組織中，因此α-SMA作為MFB的重要標(biāo)志，可指示RIF的病理進(jìn)程[13]。而RIF又與腎功能關(guān)系密切，可作為準(zhǔn)確預(yù)測(cè)腎功能惡化程度的指標(biāo)[3]。UUO模型是目前研究RIF最常用的較成熟模型，具有無(wú)高血壓、蛋白尿、血脂異常及毒性損害等特點(diǎn)，適合RIF病理機(jī)制和防治的研究[5]。1，25-（OH）2D3主要通過(guò)與其受體結(jié)合發(fā)揮其多樣生物學(xué)作用，如參與維持鈣磷平衡；與其他轉(zhuǎn)錄因子相互作用，影響基因轉(zhuǎn)錄；與其他激素、生長(zhǎng)因子及細(xì)胞因子等相互作用，參與聯(lián)系多個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)途徑，從而發(fā)揮復(fù)雜而精細(xì)的調(diào)節(jié)作用。有研究表明，腎功能降低與血清中1，25-（OH）2D3的減少呈正比關(guān)系[14]。這就說(shuō)明1，25-（OH）2D3可通過(guò)某些途徑對(duì)腎功能起保護(hù)作用，減緩腎臟的病理改變。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，UUO組腎間質(zhì)損傷和纖維化程度逐漸加重，α-SMA標(biāo)記陽(yáng)性的MFB逐漸增多；至術(shù)后第14天，腎間質(zhì)纖維化明顯，α-SMA表達(dá)達(dá)到高峰。而肌酐、尿素氮和24 h尿蛋白水平于術(shù)后第3、7天與梗阻側(cè)腎臟損傷相平行，各項(xiàng)指標(biāo)明顯升高；至第14天，各項(xiàng)指標(biāo)明顯改善，這可能與實(shí)驗(yàn)所取血液為全身血液，而此時(shí)健側(cè)腎臟發(fā)揮了全面代償作用有關(guān)。干預(yù)組與UUO組各時(shí)間點(diǎn)相比，干預(yù)組各項(xiàng)指標(biāo)改善明顯。另有體外實(shí)驗(yàn)證明，1，25-（OH）2D3能抑制轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（tranforming growth factor-β1，TGF-β1）誘發(fā)的 α-SMA 表達(dá)，并呈劑量依從關(guān)系[15]。TGF-β1是目前已知最強(qiáng)烈的促纖維化因子，可誘導(dǎo)EMT和成纖維細(xì)胞活化；而1，25-（OH）2D3的體內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)途徑與TGF-β1存在有廣泛交互的作用[16]。 1，25-（OH）2D3在 RIF 中發(fā)揮保護(hù)作用的可能機(jī)制是通過(guò)拮抗TGF-β1誘導(dǎo)的EMT和減少蛋白尿而實(shí)現(xiàn)的。

RIF是一個(gè)多因子參與、多路徑調(diào)控的復(fù)雜病理過(guò)程，其機(jī)制還有待進(jìn)一步的研究。本研究對(duì)1，25-（OH）2D3在RIF中所起的干預(yù)作用作了初步探討，為進(jìn)一步研究RIF發(fā)病機(jī)制及尋找治療方法提供了一定證據(jù)和思路。

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