TaqMan探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR快速檢測(cè)土拉弗朗西斯菌＊

趙素慧，王春暉，周 瑩，韋 耀，韓桂圓，鈕紅岺，趙 衛(wèi)，張其威，萬成松

土拉弗朗西斯菌（Francisella tularensis）能引起土拉熱（野兔熱），革蘭陰性，無孢子［1］。根據(jù)生化性質(zhì)、毒力和地理分布，分為4個(gè)亞種，土拉熱亞種（F.tularensissubsp.tularensis）主要集中在北美地區(qū)，全北區(qū)亞種（F.tularensissubsp.holarctica）主要分布在北美、歐洲和亞洲［1－2］，中亞細(xì)亞（F.tularensissubsp.mediaasiatica）與新兇手亞種（F.tularensissubsp.novicida）主要分布在北美洲，在澳大利亞也有所發(fā)現(xiàn)［3－4］，我國以全北區(qū)亞種為主［5］。1957年，我國在黃鼠體內(nèi)分離到土拉弗朗西斯菌。1959年黑龍江省報(bào)道了第一起人間 “野兔熱”［6］。1986年山東某肉類加工廠暴發(fā)了人間“野兔熱”［7］。土拉弗朗西斯菌以節(jié)肢動(dòng)物叮咬、空氣和接觸傳播為主［8］，通過黏膜或昆蟲叮咬侵入臨近組織，引起炎癥病變反應(yīng)，在巨噬細(xì)胞內(nèi)寄生，并擴(kuò)散到全身淋巴和組織器官，引起淋巴結(jié)壞死和肝脾膿腫，在臨床上表現(xiàn)為發(fā)熱、黃瘟等，嚴(yán)重者死亡。

本研究選擇具有良好抗原性的土拉弗朗西斯菌FopA外膜蛋白［9］人工合成fopA基因保守序列，旨在建立一種靈敏度高、特異性強(qiáng)、快速準(zhǔn)確地檢測(cè)土拉弗朗西斯菌的TaqMan探針熒光定量PCR方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與樣品 傷寒沙門菌“H”株（H901 50097）和炭疽芽孢桿菌減毒株（63002）由北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院惠贈(zèng)；金黃色葡萄球菌（ATCC6538）、腸出血型大腸埃希菌O157∶H7（883）和DH5ɑ由本實(shí)驗(yàn)室保存，所有細(xì)菌操作均在二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2）內(nèi)進(jìn)行。土拉弗朗西斯菌陽性模擬模板（fopA基因保守序列）由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.1.2 試劑與耗材 pUC57（Amp＋）載體為 Promega公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒為Omega Bio-Tek公司產(chǎn)品；Premix Ex TaqTM（Perfect Real Time）為TaKaRa公司產(chǎn)品，DNA marker、2×Taq Master Mix為OMEGA公司產(chǎn)品；TE溶液、LB肉湯和瓊脂平板培養(yǎng)基等自行配制。

1.1.3 儀器 美國GE Ultrospec 1100pro蛋白核酸檢測(cè)儀、德國Bio-Rad T-gradient梯度PCR儀、英國UVItec凝膠成像分析系統(tǒng)、美國Stratagene實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀Mx3005P、上海一恒THZ-100恒溫?fù)u床和生化培養(yǎng)箱等。

1.2 方法

1.2.1 設(shè)計(jì)fopA基因引物與探針 根據(jù)Larsson等土拉弗朗西斯菌外膜蛋白fopA基因序列（Gen-Bank登錄號(hào)：CP000437.1；CP000915.1；CP000439.1），利用DNAMAN軟件進(jìn)行同源性分析，確定該基因在土拉弗朗西斯菌內(nèi)的保守片段。采用Primer Premier 5.0軟件和Beacon Designer軟件設(shè)計(jì)2條PCR引物（PF、PR）和1條 TaqMan探針，在 Taq－Man探針的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ（如表1所示）。引物和TaqMan探針由生工生物工程（上海）有限公司合成。

表1 土拉弗朗西斯菌外膜蛋白fopA基因上的引物和TaqMan探針序列Tab.1 Sequences of primers and TaqMan probe for gene fopA

1.2.2 構(gòu)建fopA標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒 土拉弗朗西斯菌為嚴(yán)格管控菌種，菌體樣本較難獲得。本研究根據(jù)GenBank上的fopA基因序列，參考擴(kuò)增序列位置，人工合成一條121bp基因序列。以合成基因?yàn)槟０?，以PF、PR（見表1）為引物，PCR擴(kuò)增，產(chǎn)物回收、純化，連接到pUC57（Amp＋）載體，制備重組質(zhì)粒，后轉(zhuǎn)化到DH5ɑ感受態(tài)細(xì)胞，增殖培養(yǎng)，經(jīng)質(zhì)粒小提試劑盒抽提回收，利用蛋白核酸檢測(cè)儀測(cè)定重組質(zhì)粒濃度和純度，PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.3 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度濃度稀釋，以不同稀釋濃度的質(zhì)粒為模板，以PF、PR為引物進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)。優(yōu)化的反應(yīng)體系為Premix Ex TaqTM10.0μL、上下游引物和熒光探針（10μmol/L）各0.5μL、ROX Reference DyeⅡ0.5μL、DNA 模板2.0μL、去離子水6.0μL，共20.0μL。95℃預(yù)變性30s，以95℃10s，60℃60s（收集FAM熒光信號(hào)），擴(kuò)增40個(gè)循環(huán)，反應(yīng)時(shí)間約79min。檢測(cè)各梯度標(biāo)準(zhǔn)品的Ct值，以質(zhì)?？截悢?shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)建立質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 檢測(cè)QF-PCR靈敏度 將已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒用TE溶液進(jìn)行10倍梯度極限稀釋，以3.06×103～3.06×1010拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒模板分別進(jìn)行QF-PCR和普通PCR檢測(cè)，并用2.0%的凝膠電泳檢測(cè)。比較兩種方法對(duì)基因片段的最低檢出限。

1.2.5 檢驗(yàn)QF-PCR特異性 以含重組質(zhì)粒的DH5ɑ工程菌為陽性樣品，以傷寒沙門菌、炭疽芽孢桿菌減毒株、金黃色葡萄球菌、腸出血型大腸埃希菌等細(xì)菌作為陰性對(duì)照菌株，再用以上細(xì)菌與DH5ɑ工程菌的混合培養(yǎng)液作為模擬樣品，以去離子水作為無模板空白對(duì)照（No template control，NTC）。瓊脂平板常規(guī)培養(yǎng)細(xì)菌，挑單菌落轉(zhuǎn)到LB液體培養(yǎng)基，200r/min震蕩培養(yǎng)12～16h，最后將菌液稀釋100倍，制作樣本。普通PCR（95℃預(yù)變性10 min，95℃10s，60℃30s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，終延伸72℃5min，反應(yīng)時(shí)間約71min）和 QF-PCR（95℃預(yù)變性10min，95℃10s，60℃收集FAM熒光信號(hào)30s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)，反應(yīng)時(shí)間約75min），比較最小檢測(cè)限度。

1.2.6 QF-PCR重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 以拷貝數(shù)為3.06×106的重組質(zhì)粒作為檢測(cè)模板，相同條件分別進(jìn)行5組重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)（每組3個(gè)平行），取Ct值平均數(shù)，得出Ct值變異系數(shù)，來初步評(píng)估該方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性。

2 結(jié) 果

2.1 陽性樣品的制備與鑒定 人工合成fopA基因片段后，克隆到pUC57（Amp＋）載體，制成重組質(zhì)粒，經(jīng)抽提檢測(cè)，重組質(zhì)粒濃度為93.45ng/μL，作為陽性樣品標(biāo)準(zhǔn)品。根據(jù)Avogadro's Number計(jì)算，重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.06×1010copies/μL。取稀釋的重組質(zhì)粒作為模板，用上下游引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，2% 瓊脂糖凝膠電泳鑒定，結(jié)果如圖1所示，在100bp附近可見一條帶，大小為121bp，與預(yù)期一致。

2.2 QF-PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線 利用優(yōu)化的反應(yīng)體系，對(duì)5個(gè)10倍梯度稀釋的定量標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行QF-PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖2所示。質(zhì)粒拷貝數(shù)為橫坐標(biāo)，Ct值為縱坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，在3.06×103～3.06×109拷貝數(shù)間有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)為0.994，擴(kuò)增效率為104.8%，得出標(biāo)準(zhǔn)品拷貝數(shù)與Ct值的線性方程為：Ct＝-3.213×LOG（copies）＋41.32。對(duì)樣品進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù)其Ct值和線性方程可獲得該樣品DNA拷貝數(shù)。

2.3 QF-PCR靈敏度 將已知拷貝數(shù)的重組質(zhì)粒進(jìn)行10倍梯度極限稀釋，對(duì)3.06×106～3.06×101拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒分別進(jìn)行QF-PCR和普通PCR檢測(cè)，結(jié)果如圖3所示。QF-PCR檢測(cè)方法最低能檢測(cè)到3.06×101個(gè)DNA拷貝數(shù)，而普通PCR只能檢測(cè)到3.06×106個(gè)DNA拷貝數(shù)。

圖1 土拉弗朗西斯菌fopA基因擴(kuò)增片段鑒定M.100bp DNA Ladder marker；1.擴(kuò)增的目的片段（121bp）；2.無模板空白對(duì)照Fig.1 Identification of fopAgene amplification clipsM：100bp DNA Ladder marker；1：PCR amplification product（121bp）；2：NTC

圖2 標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒QF-PCR擴(kuò)增曲線A：標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒動(dòng)力學(xué)曲線B：標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Amplification curve of standard plasmids by QF-PCRA：QF-PCR dynamic curve of recombinant plasmids；B：Standard curve of plasmids

2.4 QF-PCR特異性 利用本實(shí)驗(yàn)建立的土拉弗朗西斯菌QF-PCR檢測(cè)方法，對(duì)4株血液、水源、接觸途徑傳播的細(xì)菌與土拉弗朗西斯菌標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，只有含fopA基因擴(kuò)增片段的2個(gè)樣品出現(xiàn)典型的擴(kuò)增曲線，其余與空白對(duì)照均為一平直線，無Ct值，如圖4所示，判斷為陰性。該結(jié)果與普通PCR檢測(cè)結(jié)果完全一致，如圖5所示，兩者比較結(jié)果如表2所示。

2.5 QF-PCR的重復(fù)性 為評(píng)估該方法的重復(fù)性和重現(xiàn)性，本研究對(duì)拷貝數(shù)為3.06×106的重組質(zhì)粒在相同實(shí)驗(yàn)條件下分別進(jìn)行5組重復(fù)檢測(cè)試驗(yàn)（每組3個(gè)平行），取Ct值平均數(shù)，最后得出Ct值變異系數(shù)，并統(tǒng)計(jì)獲得的Ct值。結(jié)果顯示，標(biāo)準(zhǔn)差為0.201，變異系數(shù)為0.88%，表明本實(shí)驗(yàn)建立的土拉弗朗西斯菌QF-PCR檢測(cè)方法重現(xiàn)性較好，可對(duì)土拉弗朗西斯菌樣品進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。

圖3 土拉弗朗西斯菌QF-PCR和普通PCR檢測(cè)的極限濃度A：QF-PCR檢測(cè)結(jié)果；B：普通PCR檢測(cè)結(jié)果。M：100bp DNA Ladder marker；1～7：拷貝數(shù)為3.06×109～3.06×103的標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒；8：無模板空白對(duì)照Fig.3 Detection limit of F.tularensis by QF-PCR and conventional PCRA：QF-PCR result；B：Conventional PCR result；M：100bp DNA Ladder marker；1-7：Plasmids copies of 3.06×109-3.06×103；8：NTC

圖4 土拉弗朗西斯菌QF-PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果1.DH5ɑ工程菌（121bp）；2.DH5ɑ混合菌a a.DH5ɑ混合菌是指含土拉弗朗西斯菌模板的DH5ɑ菌與金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、炭疽芽孢桿菌及大腸埃希菌混合后形成的模擬樣品。Fig.4 Specificity of F.tularensis by QF-PCR1：DH5ɑ（121bp）；2：DH5ɑmixa；a：Mixed bacteria of DH5ɑrefers to the cultured DH5ɑ，Staphylococcus aureus，Typhoid bacillus，Bacillus anthracis，and E.coli.

圖5 土拉弗朗西斯菌普通PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果M.50bp DNA Ladder marker；1.DH5ɑ 工 程 菌（121bp）；2.DH5ɑ混合菌a；3.金黃色葡萄球菌；4.傷寒沙門菌（H901）；5.炭疽芽孢桿菌減毒株；6.EHEC O157∶H7 883；7.無模板空白對(duì)照a.DH5ɑ混合菌是指含土拉弗朗西斯菌模板的DH5ɑ菌與金黃色葡萄球菌、傷寒沙門菌、炭疽芽孢桿菌及大腸埃希菌混合后形成的模擬樣品Fig.5 Specificity of F.tularensis by PCRM：50bp DNA Ladder marker；1：DH5ɑ （121bp）；2：DH5ɑmixa；3：Staphylococcus aureus；4：Typhoid bacillus （H901）；5：Bacillus anthracis；6：EHEC O157∶H7 883；7：NTCa：The mixed bacteria of DH5ɑrefer to the cultured DH5ɑ，Staphylococcus aureus，Typhoid bacillus，Bacillus anthracis，and E.coli.

表2 土拉弗朗西斯菌QF-PCR特異性實(shí)驗(yàn)結(jié)果Tab.2 Specificity of F.tularensis by QF-PCR

3 討 論

土拉弗朗西斯菌具有高傳染性，嚴(yán)重威脅公共衛(wèi)生安全，美國CDC將其歸為A類重要細(xì)菌，美軍把其列入為重要的生物戰(zhàn)劑目錄［10］。土拉弗朗西斯菌生長緩慢，培養(yǎng)條件苛刻，現(xiàn)今常用細(xì)菌培養(yǎng)及ELISA等檢方法，但耗時(shí)耗材，易造成實(shí)驗(yàn)室感染，極不安全。

本研究利用QF-PCR技術(shù)，選擇土拉弗朗西斯菌外膜蛋白的特異性基因fopA作為靶基因，選取其中一段保守片段設(shè)計(jì)引物和探針，構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為標(biāo)準(zhǔn)品和模擬陽性標(biāo)本，在TaqMan探針的5′端標(biāo)記熒光基團(tuán)FAM，3′端標(biāo)記淬滅基團(tuán)BHQ，利用熒光信號(hào)積累實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)人工模擬的土拉弗朗西斯菌進(jìn)行定量檢測(cè)分析，以實(shí)現(xiàn)對(duì)未知樣品中土拉弗朗西斯菌的定性定量檢測(cè)。

本實(shí)驗(yàn)所建立的QF-PCR技術(shù)的靈敏度達(dá)到30.6個(gè)DNA拷貝數(shù)水平，比普通PCR 3.06×106檢測(cè)靈敏。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，同一濃度的15個(gè)樣品檢測(cè)Ct值變異系數(shù)為0.88%，說明該方法重復(fù)性好，能保證對(duì)樣品進(jìn)行穩(wěn)定、可靠的檢測(cè)。同時(shí)QF-PCR過程中無需電泳檢測(cè)、不使用溴化乙錠，保障了實(shí)驗(yàn)人員的安全，結(jié)合菌落PCR技術(shù)更是簡(jiǎn)化了細(xì)菌基因組提取的繁瑣步驟。從樣品送檢到QFPCR反應(yīng)完成只需2h，比常規(guī)的細(xì)菌培養(yǎng)、免疫檢測(cè)等方法縮短了檢測(cè)時(shí)間，降低損耗，提高檢測(cè)效率。

本研究在無法獲得該細(xì)菌樣本的條件下，通過人工合成土拉弗朗西斯菌fopA基因的特異保守序列，構(gòu)建重組質(zhì)粒，作為檢測(cè)的模擬陽性樣品，設(shè)計(jì)引物和探針，與普通PCR進(jìn)行比較，研究QF-PCR方法的靈敏度和特異性，從而為一些高度危險(xiǎn)、難以獲得樣品的生物戰(zhàn)劑級(jí)微生物的定性定量檢測(cè)建立了一套快速、靈敏和特異的QF-PCR檢測(cè)方法。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明，fopA基因的QF-PCR檢測(cè)特異性好，檢測(cè)速度快，靈敏度高，比ELISA等其他快速檢測(cè)方法具有明顯優(yōu)勢(shì)。本研究建立的方法為土拉弗朗西斯菌的快速定量檢測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查提供了新的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)手段，適用于進(jìn)出口物品檢驗(yàn)檢疫、生物安全應(yīng)急檢測(cè)（尤其是血液樣品）、致病菌的臨床診斷以及生物安全防護(hù)等領(lǐng)域，應(yīng)用前景廣闊。

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