日本血吸蟲調(diào)寧蛋白樣蛋白P14基因疫苗對(duì)小鼠免疫保護(hù)作用研究＊

唐小牛，汪禮文，姚 勇，汪學(xué)龍

血吸蟲病是一種嚴(yán)重危害人體健康的人獸共患寄生蟲病。目前是一個(gè)全球性的重要公共衛(wèi)生問題，主要流行于非洲、拉丁美洲和亞洲的70多個(gè)國家，尤其是熱帶和亞熱帶地區(qū)，受血吸蟲病威脅的人口達(dá)6億，感染者高達(dá)2億，其中2千萬患者有較重的臨床癥狀并伴有不同程度的勞動(dòng)力喪失［1－2］，每年約有50萬患者死于血吸蟲病。因此，世界衛(wèi)生組織在70年代就提出了防治血吸蟲病的規(guī)化措施［3］。多年來，防治血吸蟲病的主要策略是以化療為主，輔以滅螺及環(huán)境衛(wèi)生管理等綜合性措施?？刂蒲x病最重要的措施仍然是應(yīng)用安全有效的抗血吸蟲藥物吡喹酮，但僅僅依靠吡喹酮化療只能減少或降低人群血吸蟲感染率，而不能阻斷疫區(qū)血吸蟲病的傳播和再感染發(fā)生［4－5］，所以化療需要反復(fù)進(jìn)行［6－7］。而且該藥對(duì)哺乳期婦女并不安全，因此有大部分感染人群不能接受治療。因此繼續(xù)尋找新的血吸蟲病防治措施成為專家學(xué)者關(guān)注的焦點(diǎn)［8］。

開展的對(duì)血吸蟲病流行區(qū)人群化療后再感染狀況的一系列調(diào)查研究表明，人體對(duì)血吸蟲感染有獲得性免疫力［9－11］，這為血吸蟲病疫苗的研制提供了理論依據(jù)。WHO認(rèn)為應(yīng)優(yōu)先考慮發(fā)展人用血吸蟲病疫苗作為化療或其它防治措施的必要補(bǔ)充，發(fā)展血吸蟲病疫苗已成為各國專家學(xué)者的共識(shí)，是世界范圍內(nèi)血吸蟲病防治科研工作的研究熱點(diǎn)［12－13］。

本研究前期試驗(yàn)中，我們對(duì)日本血吸蟲P14鈣結(jié)合蛋白樣蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和鑒定［15］。在此用無內(nèi)毒素大量質(zhì)粒提取試劑盒大量制備了真核表達(dá)重組質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）-SjP14、pcDNA3.1（＋）-SjGST 和空質(zhì)粒 pcDNA 3.1（＋），免疫BALB/c小鼠，觀察小鼠的免疫保護(hù)力，探討pcDNA3.1（＋）-SjP14作為日本血吸蟲疫苗的可能性。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 陽性釘螺 日本血吸蟲陽性釘螺購自江西省血吸蟲病防治研究所。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 體重18～22g、5～8w齡雌性BALB/c小鼠購買自安徽醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.1.3 DNA 疫 苗 pcDNA3.1（＋）-SjP14 和pcDNA3.1（＋）-SjGST 由本室構(gòu)建［14－15］。

1.1.4 主要試劑 無內(nèi)毒素大量質(zhì)粒提取試劑盒為北京百泰克生物技術(shù)公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 DNA疫苗的大量制備 －80℃取出帶重組質(zhì)粒的E.coliBL21，于3mL/3μL Amp LB液體培養(yǎng)基中，37℃，225r/min振搖3h后，轉(zhuǎn)入100 mL/100Amp LB液體培養(yǎng)基中，37℃，225r/min振搖過夜，采用北京百泰克生物技術(shù)公司無內(nèi)毒素大量質(zhì)粒提取試劑盒，按試劑盒說明書大量提取質(zhì)粒pcDNA3.1（＋）-SjP14、pcDNA3.1（＋）空質(zhì)粒和pcDNA3.1（＋）-SjGST。

1.2.2 免疫動(dòng)物 將BALB/C小鼠隨機(jī)分為4組，每組10只。分別為：生理鹽水組給予100μL/鼠/次；空質(zhì)粒組100μg/鼠/次；pcDNA3.1（＋）-SjP14組，給予 100μg/鼠/次；pcDNA3.1（＋）-SjP14＋ pcDNA3.1（＋）-SjGST 組分別給予100 μg/鼠/次。經(jīng)肌肉注射，共3次，每次間隔2w。

1.2.3 尾蚴攻擊感染 末次免疫后2w經(jīng)腹部皮膚感染日本血吸蟲尾蚴（30±1）條/鼠。

1.2.4 用 ELISA 方法檢測(cè)IgG1、IgG2a、總IgG 于首次免疫前1d、尾蚴攻擊前1d、解剖前1d分別經(jīng)眶靜脈采血，分離血清，－20℃保存?zhèn)溆谩Ｓ肊LISA方法檢測(cè)IgG1、IgG2a、總IgG。

1.2.5 免疫保護(hù)效果觀察 尾蚴攻擊6w后解剖小鼠，行左心室－門靜脈灌注沖洗收集成蟲，計(jì)算減蟲率；留取肝臟，部分用5%KOH消化后在顯微鏡下行蟲卵計(jì)數(shù)，計(jì)算減卵率。部分肝臟用于組織病理學(xué)分析（HE染色法），觀察肝細(xì)胞變化及肉芽腫情況。

減蟲率：分別計(jì)數(shù)每只小鼠中血吸蟲成蟲數(shù)，計(jì)算每組小鼠的平均成蟲數(shù)和雌蟲數(shù)，按如下公式計(jì)算：

減卵率：稱取鼠肝總重量，按常規(guī)方法用5%的KOH消化1g肝組織，計(jì)算每克肝組織蟲卵數(shù)（EPG），按下述公式計(jì)算肝組織減卵率：

1.2.6 小鼠肝臟切片HE染色

1.2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 數(shù)據(jù)錄入excel2003，采用spss11.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以±s表示，多組間比較采用方差分析，以α＝0.05為檢驗(yàn)水準(zhǔn)。

2 結(jié) 果

2.1 小鼠肝臟組織學(xué)的變化 大體解剖可見生理鹽水組肝臟表面可見彌漫性粟粒樣蟲卵結(jié)節(jié)分布，結(jié)節(jié)隆起密集，體積較大，空質(zhì)粒組肝臟呈暗褐色，質(zhì)硬，表面有溝紋，可見大量灰白色蟲卵結(jié)節(jié)。pcDNA3.1（＋）-SjP14核酸疫苗組小鼠肝臟色澤略帶暗紅色，質(zhì)地較軟，表面較光滑，隱約可見少量灰白色小點(diǎn)，蟲卵結(jié)節(jié)較少；SjP14＋SjGST核酸疫苗聯(lián)用組，肝臟顏色呈鮮紅色，表面光滑，蟲卵結(jié)節(jié)少，質(zhì)軟。組織切片鏡下顯示（圖1），生理鹽水組肝組織中可見大量的蟲卵肉芽腫形成，肉芽腫體積較大，周圍有大量淋巴細(xì)胞、嗜酸性細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤(rùn)，大量的肝細(xì)胞變性壞死；空質(zhì)粒組也見大量肉芽腫，周圍有大量淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，但是肝細(xì)胞變性壞死度較重；pcDNA3.1（＋）-SjP14組肝臟病較生理鹽水組明顯減輕，小鼠肝細(xì)胞混濁腫脹，偶見壞死的肝細(xì)胞，匯管區(qū)卵肉芽腫數(shù)量減少，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)主要以嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞為主，可見少量巨嗜細(xì)胞和漿細(xì)胞pcDNA3.1（＋）-SjP14＋SjGST病變程度最輕，肝小葉結(jié)構(gòu)完整，蟲卵肉芽腫周圍炎癥反應(yīng)輕，細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，肉芽腫面積較小。

2.2 血清IgG1、IgG2a、總IgG的檢測(cè) 圖2、圖3、圖4分別顯示，免疫6w后，SjP14組小鼠血清抗體IgG1、IgG2a和總IgG均較對(duì)照組明顯升高，SjP14＋SjGST聯(lián)合應(yīng)用作用更顯著。

圖1 各組小鼠肝臟病理切片（HE染色）A.生理鹽水組 B.空質(zhì)粒組 C.SjP14組 D.SjP14＋SjGST組Fig.1 Photomicrographs of liver in each group（HE stain）A：NS group；B：pcDNA3.1（＋）vector group；C：SjP14group；D：SjP14＋SjGST group

圖2 各組小鼠血清特異性IgG1抗體水平Fig.2 Specific IgG1antibody in sera of mice

圖3 各組小鼠血清特異性IgG2a抗體水平Fig.3 Specific IgG2aantibody in sera of mice

圖4 各組小鼠血清特異性總IgG抗體水平Fig.4 Total IgG antibody in sera of mice

2.3 減蟲率和減卵率 由表1可見，SjP14核酸疫苗能明顯減少被尾蚴攻擊小鼠靜脈內(nèi)成蟲數(shù)量，SjGST和SjP14核酸疫苗共同免疫則能提高SjP14疫苗抗尾蚴感染的作用，減蟲率分別達(dá)到44.6%（P＜0.05），56.2%（P＜0.01）。由表2可見，SjP14組和SjGST和SjP14聯(lián)合組小鼠肝臟內(nèi)蟲卵數(shù)明顯低于生理鹽水和空質(zhì)粒對(duì)照組（P＜0.01），SjGST和SjP14聯(lián)合組減卵率由單用SjP14的61.5%提高到73.6%。

2.4 減卵率（表2）

表1 各組小鼠的成蟲檢獲情況（±s）Tab.1 Reduction rate of worm burden in each group（±s）

表1 各組小鼠的成蟲檢獲情況（±s）Tab.1 Reduction rate of worm burden in each group（±s）

與對(duì)照組比較：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01Compared with control group：＊P＜0.05，＊＊P＜0.01

組別Group小鼠數(shù)（只）No.mice成蟲數(shù)（條/鼠）Worm burden減蟲率（%）Reduction rate（%）生理鹽水Saline 10 22.4±1.9空質(zhì)粒Empty plasmid 10 21.8±1.8 SjP14 10 12.3±1.4 44.6＊SjP14＋SjGST 10 9.8±1.6 56.2＊＊

表2 各組小鼠的蟲卵檢獲情況（±s）Tab.2 Reduction rate of liver egg in each group（±s）

表2 各組小鼠的蟲卵檢獲情況（±s）Tab.2 Reduction rate of liver egg in each group（±s）

與對(duì)照組比較：＊：P＜0.01，＊＊：P＜0.01Compared with control groups：＊：P＜0.01，＊＊：P＜0.01

?

3 討 論

核酸疫苗能夠把一個(gè)或幾個(gè)編碼目標(biāo)抗原的cDNA片段克隆到真核表達(dá)載體內(nèi)，并表達(dá)出近似天然的抗原，從而誘導(dǎo)出較強(qiáng)的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答。DNA疫苗進(jìn)入體內(nèi)，少量被宿主細(xì)胞攝取后進(jìn)入細(xì)胞核，在載體啟動(dòng)子的操縱下，抗原基因轉(zhuǎn)錄為mRNA，該mRNA又被胞漿粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的核糖體翻譯生成細(xì)胞質(zhì)內(nèi)蛋白質(zhì)。少量表達(dá)的蛋白在細(xì)胞內(nèi)被水解酶降解成8～12個(gè)氨基酸的短肽，這些短肽含有不同的抗原表位，相關(guān)蛋白通過轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔，與I型MHC分子的重鏈及β2－微球蛋白結(jié)合在一起，通過高爾基復(fù)合體轉(zhuǎn)移出細(xì)胞質(zhì)，定位于細(xì)胞表面，被CD＋4T細(xì)胞識(shí)別，刺激MHCI型限制分子的CD＋4細(xì)胞毒性T細(xì)胞產(chǎn)生抗原特異性CTL，對(duì)表達(dá)外源基因的細(xì)胞發(fā)揮細(xì)胞毒性作用［16］。

已進(jìn)行與日本血吸蟲疫苗相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，獲得了不少日本血吸蟲抗原，但這些抗原只能起到部分保護(hù)作用，它們?nèi)匀粵]有達(dá)到致弱尾蚴保護(hù)作用的水平［12］。因此有必要繼續(xù)尋找新的疫苗抗原分子，促進(jìn)血吸蟲疫苗研發(fā)的進(jìn)程。

現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)調(diào)寧蛋白具有很多生物學(xué)功能，包括（1）參與平滑肌收縮的調(diào)控；（2）參與細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)；（3）維持細(xì)胞骨架；（4）參與血管病變及腫瘤的基因調(diào)節(jié)。不管脊椎動(dòng)物還是無脊椎動(dòng)物在其生命活動(dòng)當(dāng)中調(diào)寧蛋白都發(fā)揮著重要作用。調(diào)寧蛋白樣蛋白已經(jīng)在許多無脊椎動(dòng)物中被克隆和表征，包括最近報(bào)道的棘球絳蟲、盤尾絲蟲、秀麗小桿線蟲及日本血吸蟲等4種寄生蟲［17－19］。目前已知的日本血吸蟲疫苗的抗原免疫保護(hù)都沒有達(dá)到50%水平，而旋盤尾絲蟲的OV9M基因編碼的堿性調(diào)寧蛋白樣蛋白具有高度免疫原性，所以本實(shí)驗(yàn)選擇日本血吸蟲的堿性調(diào)寧蛋白樣蛋白作為抗原，以觀察該抗原的免疫保護(hù)力。結(jié)果表明，pcDNA3.1（＋）-SjP14DNA 疫苗能誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生顯著的抗日本血吸蟲感染的保護(hù)性免疫作用，pcDNA3.1（＋）-SjP14 ＋SjGST 聯(lián)合應(yīng)用其作用增強(qiáng)。與生理鹽水組和空質(zhì)粒組相比較，其減蟲率和減卵率均有顯著性差異。小鼠肝臟切片HE染色顯示其肝細(xì)胞壞死、蟲卵量、炎性細(xì)胞的浸潤(rùn)均明顯減輕。本實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)特異性IgG1和IgG2a抗體水平均明顯升高，以初次免疫后12w時(shí)最明顯，攻擊感染后有較明顯下降，提示可能誘導(dǎo)了Thl/Tcl型和Th2/Tc2型混合型應(yīng)答。通過以上分析提示SjP14有希望作為一種新的、有效的抗日本血吸蟲感染的候選疫苗分子。

［1］Chitsulo L，Engels D，Montresor A，et al.The global status of schistosomiasis and its control［J］.Acta Trop，2000，77（1）：41-51.DOI：10.1016/S0001-706X（00）00122-4

［2］Department of International Cooperation，Ministry of Health，China.Schistosomiasis fact sheet［R］.World Health Organization Bulletin，2008，404（2）：13-14.（in Chinese）衛(wèi)生部國際合作司國際合作處.血吸蟲病的實(shí)況報(bào)道［R］.世界衛(wèi)生組織簡(jiǎn)報(bào)，2008，404（2）：13-14.

［3］Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases.Tropical disease research：progress 1975-94：highlights 1993-94：twelfth programme report of the UNDP/World Bank/WHO Special Programme for Research and Training in Tropical Diseases（TDR）［M］.Geneva：World Health Organization，1995：77.

［4］Chen MG.Schistosomiasis in the world and its control progress［J］.Chin J Schisto Control，2002，14（2）：81-83.（in Chinese）陳銘剛.世界血吸蟲病流行情況及防治進(jìn)展［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2002，14（2）：81-83.

［5］Jiang Y，Jiang ZJ.Overview on drug research for schistosomiasis control［J］.Chin J Schisto Control，2001，13（1）：59-60.（in Chinese）江艷，蔣作君.血吸蟲病防治藥物研究概況［J］.中國血吸蟲病防治雜志，2001，13（l）：59-60.

［6］Yuan HC，Zhang SJ，Liu ZL，et al.Research on epidemiological factors and optimization control strategy for schistosomiasis in lakeshore areas［J］.Chin J Schisto Control，1995，7（4）：1993-2001.（in Chinese）袁鴻昌，張紹基，劉志德，等.湖灘地區(qū)血吸蟲病流行因素與優(yōu)化控制策略的研究［J］.中國血吸蟲病防治雜志，1995，7（4），1993-2001

［7］Wu ZD，Zhang SJ，Pan BR，et asl.Reinfection withSchistosoma japonicumafter treatment with praziquantel in Poyang lake region，China［J］.Southeast Asian J Trop Med Public Health，1994，25（1）：163-169.

［8］Bergquist NR，Colley DG.Schistosomiasis vaccines：research to development［J］.Parasitol Today，1998，14（3）：99-104.DOI：10.1016/S0169-4758（97）01207-6

［9］Gryseels B.Human resistance toSchistosomainfection：Age or experiencef［J］.Parasitol Today，1994，10（10）：380-384.DOI：10.1016/0169-4758（94）90226-7

［10］Waine GJ，McManus DP.Schistosomiasis vaccine development－－the current picture［J］.Bioessay，1997，19 （5）：435-443.DOI：10.1002/bies.950190511

［11］Zhang Z，Wu H，Chen S，et al.Association between IgE antibody against soluble egg antigen and resistance to reinfection withSchistosomiasis japonica［J］.Trans R Soc Trop Med Hyg，1997，91（5）：606-608.DOI：10.1016/S0035-9203（97）90047-X

［12］Bergquist NR，AI-Sherbiny M，Barakat R，et al.Blueprint for schistosomiasis vaccine development［J］.Acta Trop，2002，82（2）：183-192.DOI：10.1016/S0001-706X（02）00048-7

［13］Bergquist NR，Leonardo LR，Mitchell GF.Vaccine-linked chemotherapy：can schistosomiasis control benefit from an integrated approach［J］.Trends Parasitol，2005，21 （3）：112-117.DOI：10.1016/j.pt.2005.01.001

［14］Luo QL，Shen JL，Wang XL，et al.Immunodiagnosis of acute schistosomiasis using 26ku glutathione-S-transferase recombinant protein ofSchistosoma japonicum［J］.Acta U Medicinalis Anhui，2005，40（6）：491-494.（in Chinese）羅慶禮，沈繼龍，汪學(xué)龍，等.重組日本血吸蟲26ku谷胱甘肽－硫－轉(zhuǎn)移酶的表達(dá)、純化及其免疫特性分析用于急性血吸蟲病免疫診斷［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，40（6）：491-494.

［15］Wang LW，Tang XN，Yao Y，et al.Construction，expression and identification of the eukaryotic expression vector carryingSchistosoma japonicumP14gene［J］.Acta U Medicinalis Anhui，2011，46（4）：321-324.（in Chinese）汪禮文，唐小牛，姚勇，等.日本血吸蟲P14鈣結(jié)合蛋白樣蛋白基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建、表達(dá)和鑒定［J］.安徽醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，46（4）：321-324.

［16］Simmonds RS，Sheaer MH，Kennedy RC.DNA vaccines-From principle to practice［J］.Parasitol Today，1997，13（9）：328-331.DOI：10.1016/S0169-4758（97）01106-X

［17］Martin RM，Gasser RB，Jones MK，et al.Identification and characterization of myophilin，a muscle-specific antigen ofE-chinococcus granulosus［J］.Mol Biochem Parasitol，1995，70（1-2）：139-148.DOI：10.1016/0166-6851（95）00020-2

［18］Irvine M，Huima T，Prince AM，et al.Identification and characterization of anOnchocerca volvuluscDNA clone encoding a highly immunogenic calponin-like protein［J］.Mol Biochem Parasitol，1994，65（1）：135-146.DOI：10.1016/0166-6851（94）90122-8

［19］Goetinck S，Waterston RH.TheCaenorhabditis elegansmuscle-affecting geneunc-87encodes a novel thin filament-associated protein［J］.J Cell Biol，1994，127（1）：79-93.