捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵體外培養(yǎng)觀察

葉勇剛，魏 勇，康潤敏，葉建強，肖 璐，曹 冶，謝 晶，于吉峰，李興玉，潘 夢，戴卓建，林 毅，廖黨金

（四川省畜牧科學(xué)研究院 動物遺傳育種四川省重點實驗室，成都 610066）

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲（Haemonchus contortus）屬毛圓科（Trichostrongylidae）血矛屬（Haemonchus），廣泛寄生于牛、羊、鹿和駱駝等反芻動物的皺胃或小腸中。該線蟲主要靠吸食宿主血液而生，造成宿主貧血、消瘦，嚴重可致幼畜尤其羔羊大批死亡，給畜牧業(yè)造成巨大的經(jīng)濟損失[1-4]。當(dāng)前流行的寄生蟲病檢測方法有蟲卵檢測、免疫學(xué)檢測和核酸檢測，這些方法對于鑒別診斷捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病非常重要[5-7]。其中，蟲卵檢測具有直觀、準確、操作簡單，能夠反映宿主感染程度等優(yōu)點，是寄生蟲病非常經(jīng)典、有效和常用的方法，如麥氏蟲卵檢測法、加藤厚涂片法、廖氏蟲卵檢測法、Mini FlOTAC法等[8-12]，這些方法在檢測蟲卵時，各有優(yōu)缺點。由于多數(shù)蟲卵在外觀形態(tài)上極為相像，往往只有經(jīng)驗豐富的檢驗人員能依據(jù)蟲卵形態(tài)進行判定，利用這些檢測技術(shù)也難以將捻轉(zhuǎn)血矛線蟲與消化道其它線蟲鑒別開來。另外，Megan等[13-14]報道捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵能特異性地結(jié)合花生凝集素，用此方法能鑒別毛圓科的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲，但牛羊等反芻動物流行的消化道線蟲除毛圓科外，還有夏伯特科等其它與捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵形態(tài)相似的線蟲，這在一定程度上也限制了該方法的應(yīng)用。為此，展開捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵形態(tài)和體外發(fā)育研究，不僅能補充捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵在外界的發(fā)育狀況知識，而且還能為糞便蟲卵檢測提供形態(tài)學(xué)參考，有利于開展捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的研究和防控。

1 材料和方法

1.1 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵成熟蟲卵由涼山半細毛羊和南江黃羊皺胃中分離而來的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲在體外短暫培養(yǎng)自然排出，非成熟蟲卵由捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲子宮剖檢而來。

1.2 主要儀器OLYPUS CX41顯微鏡和MSX2科研級數(shù)字攝像系統(tǒng)。

1.3 蟲卵的收集和體外培養(yǎng)從涼山半細毛羊和南江黃羊皺胃分離捻轉(zhuǎn)血矛線蟲成蟲，經(jīng)生理鹽水反復(fù)洗淘后，選取10條雌蟲于盛有生理鹽水的玻璃試管中，36．5℃條件下培養(yǎng)，約經(jīng)20 h后成蟲死亡并用挑蟲針挑出蟲體，培養(yǎng)液經(jīng)280×g離心后，小心去掉上清液，剩余液體即為蟲卵懸液，重新加入適量生理鹽水，于敞口玻璃試管中室溫（16℃～29℃）培養(yǎng)，每天觀察后小心棄掉上清液并重新補充生理鹽水。

1.4 觀察及圖像測量從開始培養(yǎng)起，每日從蟲卵液中吸取適量蟲卵于載玻片，在400倍放大下采集蟲卵圖像，同時對蟲卵長和寬進行測量；通過輕輕移動蓋玻片，滾動蟲卵以觀察蟲卵各個面是否對稱。依據(jù)每日連續(xù)3次吸取蟲卵觀測所得數(shù)據(jù)，統(tǒng)計蟲卵每日的發(fā)育情況。

2 結(jié)果與討論

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵外觀多呈短橢圓形，少數(shù)見不對稱面，約占15．79%（圖1），卵殼光滑、薄、雙層，蟲卵淺灰或黃褐色；蟲卵大?。洪L81．27 μm± 5．59 μm（70．17 μm～97．72 μm），寬54．34 μm± 6．63 μm（42．61 μm～69．33 μm），長寬比1．51 ± 0．14。分離自綿羊和山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲的蟲卵大小差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義（表1）。

圖1 不對稱的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵Fig.1 The asymmetrical eggs of Haemonchus contortus

表1 分離自綿羊和山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵的外觀尺寸Table 1 the length, width and aspect ratio of eggs from Haemonchus contortus parasited in sheeps and goats

由雌性成蟲自然排出的成熟蟲卵，初期胚胎多呈收縮狀態(tài)似桑葚，約經(jīng)10～12 h蟲卵超過50%變?yōu)樯］仄谙x卵，后期逐漸發(fā)育經(jīng)歷蝌蚪期、含幼蟲期，直至幼蟲逸出；非成熟蟲卵胚胎充滿整個蟲卵腔室，后期不發(fā)育，具體見圖2～5。分離自綿羊和山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵，在體外發(fā)育至各階段的時間略有差異，50%及以上蟲卵發(fā)育至蝌蚪期時間大致為3 ～4 d，50%及以上蟲卵發(fā)育至幼蟲期所需時間約6～7 d，蟲卵中幼蟲逸出時間最早在第6 d，至第9 d幼蟲全部逸出（表2）。從蟲卵剛逸出的幼蟲為1期幼蟲，從1期幼蟲逐漸發(fā)育至3期幼蟲，其口器、食道、腸道等器官逐漸清晰，幼蟲的尾端均尖細，但無法區(qū)別雌雄蟲，1期和2期幼蟲見圖6。

表2 分離自綿羊和山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵在體外發(fā)育至各階段的時間Table 2 The time that the two eggs from Haemonchus contortus parasited in sheeps and goats needs to develop into different stages in vitro

圖2 非成熟捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵Fig.2 Immature eggs of Haemonchus contortus

圖3 桑葚期蟲卵Fig.3 The eggs whose embryo like mulberry

圖4 蝌蚪期蟲卵Fig.4 the eggs whose embryo like tadpole

圖5 幼蟲期蟲卵Fig.5 The eggs whose embryo like snake

圖6 捻轉(zhuǎn)血矛線蟲1期（左）和2期幼蟲（右）Fig.6 The L1 stage larvae (left) and the L2 stage Larvae(right)

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵在不同的文獻記載中，其大小不盡相同。據(jù)孔繁瑤[1]報道捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵大小為75～95 μm×40～50 μm，蔣學(xué)良[15]報道捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵大小為55～65 μm×3 0～43 μm，趙媛媛[16]記錄該線蟲蟲卵大小為66～82 μm×3 9～46 μm，陳少博等[17]則測得蟲卵長71．13 μm±2．69 μm、寬42．68 μm±2．47 μm。而在本研究中，所測捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵大小為（70．17～97．72 μm）×（42．61～ 69．33 μm），其尺寸均比上述文獻報道的要大，而且分離自綿羊和山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵在長、寬和長寬比上還存在差異顯著，具有統(tǒng)計學(xué)意義。這也許與不同地域或不同宿主分離的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵，以及觀察蟲卵數(shù)量的多少有關(guān)。此外，對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵的觀察還發(fā)現(xiàn)少數(shù)蟲卵存在不對稱面，約占蟲卵總數(shù)的15．79%，在文獻中未曾報道。

捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵自排出蟲體后，胚胎細胞會不斷發(fā)育，約經(jīng)10 h左右，多數(shù)成熟蟲卵可見16～32個胚細胞，形似桑葚，為桑葚期蟲卵，隨后發(fā)育直至蝌蚪期和幼蟲期，直至幼蟲逸出[18-19]。據(jù)報道，蟲卵在體外20．5℃和26℃時，發(fā)育至3期幼蟲分別需要204 h和132 h[20]。一般1期幼蟲發(fā)育至3期幼蟲，大致需要2 d，也就是蟲卵在這2種溫度條件下多數(shù)發(fā)育至幼蟲逸出時間大致為5．5 d和3．5 d。本試驗中，蟲卵在生理鹽水中進行孵化未恒定在一個溫度，觀察時間集中在5月10～17日，溫度范圍為16℃～29℃，多數(shù)蟲卵經(jīng)3～4 d發(fā)育至蝌蚪期并見少數(shù)幼蟲期蟲卵，6～7 d后多數(shù)蟲卵發(fā)育至幼蟲期，且第6 d見有1期幼蟲逸出，孵化至第9 d，幼蟲均從蟲卵中逸出，相比文獻中記錄的蟲卵發(fā)育速度要慢，說明蟲卵在體外發(fā)育的速度與溫度相關(guān)。

本試驗同時對分離自綿羊和山羊的捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵進行體外孵化觀察，對蟲卵發(fā)育至各階段所需時間、蟲卵外觀尺寸等數(shù)據(jù)進行分析，不僅豐富了對捻轉(zhuǎn)血矛線蟲蟲卵體外發(fā)育的認知，更能有助于指導(dǎo)基層開展捻轉(zhuǎn)血矛線蟲病的蟲卵檢查和防控。