姜黃素對(duì)急性腹膜炎大鼠腹膜Toll樣受體2和6表達(dá)的影響

張秀麗 孫 麗 樊 怡 王力寧 馬健飛

腹膜透析(PD)是終末期腎病的主要替代療法之一，盡管技術(shù)不斷進(jìn)步，腹膜炎仍然是其主要并發(fā)癥和退出PD的主要原因，其中表皮葡萄球菌是其主要致病菌［1］。Toll樣受體(TLR)是重要的膜受體家族，近年來，TLR在機(jī)體防御反應(yīng)中的作用備受關(guān)注，其介導(dǎo)的天然免疫反應(yīng)是機(jī)體對(duì)感染因素入侵的第一道防線。迄今為止，TLR家族已經(jīng)發(fā)現(xiàn)10個(gè)成員［2－4］。其中TLR2和 TLR6主要識(shí)別革蘭陽性菌成分［5，6］。核因子 κB(NF－κB)是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，普遍存在于體內(nèi)快反應(yīng)有核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中，位于TLR下游信號(hào)通路的樞紐位置，通過調(diào)節(jié)免疫和炎癥相關(guān)因子及炎性遞質(zhì)之間的級(jí)聯(lián)放大瀑布效應(yīng)，在炎癥和免疫反應(yīng)中起樞紐作用［7，8］。姜黃素具有多方面的藥理作用機(jī)制，在基因和細(xì)胞信號(hào)通路多水平上具有抗炎、抑菌、抗氧化應(yīng)激、抗癌、免疫調(diào)節(jié)等方面的復(fù)合特性［9］。姜黃素可下調(diào)多種炎癥相關(guān)因子，如白細(xì)胞介素6(IL－6)，腫瘤壞死因子α(TNF－α)以及化學(xué)增活素［10］。這些炎癥因子都是TLR家族在免疫調(diào)節(jié)途徑中的下游因子。然而，表皮葡萄球菌誘發(fā)急性腹膜炎時(shí)，姜黃素對(duì)腹膜組織TLR2和TLR6的表達(dá)有何影響，如何調(diào)節(jié)NF－κB信號(hào)通路及其炎癥效應(yīng)等問題目前尚無相關(guān)報(bào)導(dǎo)。因此，本研究擬探討姜黃素干預(yù)PD相關(guān)性腹腔局部炎癥的作用及其機(jī)制。

材料與方法

材料 清潔級(jí)SD雄性大鼠80只(體重250～300g)，由中國醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。

儀器 切片機(jī)(JUNG CM1800，Leica，德國);蛋白電泳儀(MINI－PROTEIN II，BIO－RAD，美國)，DNA擴(kuò)增儀(UNOI248 BIOMETRAGER，德國)等。

主要試劑 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(杭州博日)，NF－κB多克隆抗體 (Santa Cruz)。大鼠TNF－α ELISA試劑盒(武漢博士德公司);表皮葡萄球菌由中國醫(yī)科大學(xué)臨床微生物室饋贈(zèng)。菌液的制備:將表皮葡萄球菌菌株接種于300 ml腦心浸液肉湯培養(yǎng)基，以150 r/min 37℃震蕩培養(yǎng)過夜。4℃下6 000 r/min離心取沉淀。用50 ml預(yù)冷的生理鹽水混勻同前離心取沉淀，同法洗菌3次。最后沉淀用20 ml預(yù)冷的鹽水混勻，配制濃度為5×1010CFU/ml的菌液4℃保存?zhèn)溆?。根?jù)以往文獻(xiàn)［11］及預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，繪制回歸曲線計(jì)算半數(shù)致死量LD50，選擇實(shí)驗(yàn)細(xì)菌濃度為107CFU/ml。

方法

分組 80只清潔級(jí)SD雄性大鼠，分為三組:對(duì)照組20只，模型組及姜黃素處理組各30只。對(duì)照組大鼠腹腔注射PBS，而模型組則腹腔注射表皮葡萄球菌溶液(107CFU/ml，溶于 PBS)［11］。姜黃處理組在注射表皮葡萄球菌前24h，先腹腔注射姜黃素(50 mg/kg，溶于二甲基亞砜)［12］。分別于感染后3h，6h，12h，24h，48h 后將大鼠處死并取材。

標(biāo)本留取和檢測 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物乙醚麻醉后，沿腹白線剪開腹壁，用滅菌吸管吸腹水1ml注于EDTA試管中做腹水檢測。然后迅速取出腹膜，部分材料浸入4%多聚甲醛溶液內(nèi)固定24h(4℃)，常規(guī)制備連續(xù)石蠟切片，用于免疫組織化學(xué)染色。部分材料深凍冰箱凍存，用于檢測Western Blot及RT－PCR實(shí)驗(yàn)。

HE染色 取石蠟包埋的臟層和壁層腹膜組織，做2 μm切片，60℃烘干融蠟，然后以二甲苯脫蠟，將切片置于蘇木精染色液中15～20 min后沖洗;切片置于0.5%HCL乙醇中數(shù)秒，水洗3次后稍浸泡;常規(guī)方法HE染色，光鏡下觀察病理改變結(jié)果。

免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片10 μm經(jīng)二甲苯脫蠟，PBS沖洗，微波煮沸抗原修復(fù)，自然冷卻，PBS沖洗。用于NF－κB免疫組化染色的標(biāo)本，5%BSA室溫孵育1h，NF－κB 抗體(1∶100)4℃孵育過夜，0.01M PBS充分漂洗，生物素－山羊抗兔IgG(1∶200)室溫孵育2h，0.05M Tris－HCl充分漂洗，SABC 試劑室溫孵育1h，漂洗后二甲基聯(lián)苯胺(DAB)和 H2O2Tris－HCL緩沖液顯色10 min，蒸餾水沖洗終止反應(yīng)，甲苯胺蘭復(fù)染，常規(guī)梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片，光學(xué)顯微鏡下觀察并采集圖像和分析，圖片經(jīng)Photoshop CS4軟件處理并打印。

Western Blot 樣品剪碎后加入裂解液4℃過夜。考馬斯亮藍(lán)法進(jìn)行蛋白定量，各組取等量蛋白，聚丙酰胺凝膠電泳分離，并轉(zhuǎn)至PVDF膜上;脫脂奶粉溶液封閉3～7h;一抗4℃孵育過夜;二抗常溫下孵育2h;然后進(jìn)行顯色、曝光、膠片掃描、定量分析。

RT－PCR 采用Trizol一步法提取大鼠腹膜總RNA，然后進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用引物為:TLR2(5＇－GGAGGTGTTGGATGTTAG－3＇;5＇－GCTTGAAGGGTGG GTC－3＇);TLR6(5＇－ACTCACCAGAGGTCCAA－3＇;5＇－GGATGAATGGCGTGTC－3＇)。PCR 擴(kuò)增后，PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物用3%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳分離觀察，成像，Image－pro Plus 6.0軟件包分析。

ELISA法檢測腹水TNF－α的表達(dá) 按照TNF－α ELISA試劑盒操作說明測定大鼠腹水中TNF－α蛋白濃度，450 nm波長測量各孔的光密度值，TNF－α含量計(jì)算結(jié)果以pg/ml表示。

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 全部數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件分析。計(jì)量資料用ˉx±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

腹膜組織學(xué)改變 模型組和姜黃素處理組大鼠腹腔注射表皮葡萄球菌后，腹膜出現(xiàn)水腫和細(xì)胞形態(tài)改變。選取腹腔注射表皮葡萄球菌后24h的腹膜切片、HE染色發(fā)現(xiàn)，模型組腹膜組織損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)水腫，細(xì)胞變形、碎裂;姜黃素處理組也存在一定程度的腹膜組織損傷，但程度輕于模型組(圖1)。

NF－κB免疫組織化學(xué)染色 NF－κB免疫陽性反應(yīng)主要位于腹膜間皮細(xì)胞層(圖2)。NF－κB免疫組織化學(xué)染色逐漸增強(qiáng)，在24h達(dá)高峰，故選擇24h作為本組實(shí)驗(yàn)的時(shí)間點(diǎn)。與模型組相比，姜黃素處理組NF－κB免疫組織化學(xué)染色在注射表皮葡萄球菌后明顯減弱。

圖1 大鼠腹腔注射表皮葡萄球菌后24h的腹膜形態(tài)學(xué)改變(HE，×400)1A:對(duì)照組;1B:模型組腹膜組織損傷嚴(yán)重，出現(xiàn)水腫，細(xì)胞變形、碎裂;1C:姜黃素處理組也存在一定程度的腹膜組織損傷，但程度輕于模型組圖2 臟層腹膜核因子κB(NF-κB)染色(IH，×400)2A:對(duì)照組;2B:模型組NF－κB免疫陽性反應(yīng)主要位于腹膜間皮細(xì)胞層;2C:與模型組相比，姜黃素處理組NF－κB免疫組織化學(xué)染色在注射表皮葡萄球菌后明顯減弱

TLR2和TLR6 mRNA表達(dá) 采用RT－PCR技術(shù)對(duì)TLR2和TLR6 mRNA水平表達(dá)進(jìn)行了分析(圖3)。圖3A為TLR2和TLR6 mRNA表達(dá)的典型條帶。在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)，TLR2和TLR6 mRNA表達(dá)趨勢一致，在感染后6～24h呈時(shí)間依賴性上升。與模型組相比，姜黃素處理組TLR2和TLR6 mRNA表達(dá)明顯減少并具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖3B)。

NF－κB表達(dá) 采用 Western Blot技術(shù)對(duì) NF－κB的蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析(圖4)。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，與模型組相比，姜黃素處理組NF－κB蛋白表達(dá)含量明顯下降。

腹水TNF－α 表皮葡萄球菌刺激3h后，腹水TNF－α水平逐漸升高至48h后有所回降。與模型組相比，姜黃素處理組TNF－α表達(dá)含量在感染后6h、12h及24h明顯下降(P＜0.01)(圖5)。

討 論

圖3TLR2和TLR6的RT-PCR檢測結(jié)果

圖4 NF-κB表達(dá)的Western Blot檢測結(jié)果

圖5 大鼠腹水TNF-α蛋白表達(dá)變化

反復(fù)發(fā)生腹膜炎可致PD患者營養(yǎng)不良、腹膜硬化黏連及超濾能力喪失，是患者退出PD的主要原因。表皮葡萄球菌是PD相關(guān)性腹膜炎的重要致病菌，極易耐藥且很難徹底清除。因此，探討其致病機(jī)制和預(yù)防措施具有重要臨床意義［13］。TLR是迄今認(rèn)識(shí)的第一個(gè)機(jī)體通過感知微生物病原體直接做出防御反應(yīng)的天然免疫受體。研究表明各類TLR表達(dá)在參與宿主第一線防御的細(xì)胞上，如來自腸道和肺的巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，表明TLR在發(fā)現(xiàn)微生物和激活特異性免疫系統(tǒng)中的重要作用［2］。TLR通過病原分子相關(guān)模式(pathogen－associated molecular patterns，PAMS)對(duì)配體進(jìn)行識(shí)別。TLR6不直接識(shí)別配體，而是通過與TLR2配對(duì)形成異源二聚體的形式發(fā)揮作用［14］。Aderem等［2］研究提示TLR2和TLR6協(xié)同作用可能參與對(duì)所有TLR2配體的識(shí)別，而且實(shí)驗(yàn)還證實(shí)融合的TLR2和TLR6可以抑制其配體的激活過程。本研究采用RT－PCR技術(shù)證實(shí)正常大鼠腹膜組織中存在TLR2和TLR6的少量表達(dá)，而模型組的大鼠腹膜組織TLR2和TLR6基因表達(dá)較對(duì)照組明顯增加，說明其與表皮葡萄球菌腹膜炎相關(guān)，且隨著感染時(shí)間的延長，模型組的大鼠腹膜組織TLR2和TLR6的基因表達(dá)逐漸增加。腹膜組織內(nèi)的細(xì)菌載量亦隨之增加，故可以認(rèn)為腹膜組織TLR2和TLR6基因表達(dá)增加與其細(xì)菌載量增加激活TLR2和TLR6有關(guān)。

動(dòng)物體內(nèi)存在許多信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，TLR－NF－κB－細(xì)胞因子通路是其中之一，其主要作用是調(diào)控機(jī)體內(nèi)在免疫反應(yīng)。TLR通過 PAMS激活 MyD88，使IL－1相關(guān)激酶1(IRAK－1)磷酸化并與腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子6(TRAF6)結(jié)合，參與激活轉(zhuǎn)化生長因子β的蛋白激酶1(TAKI)和TAKI結(jié)合蛋白1和2(TAB1，TAB2)的復(fù)合物的形成，TAKI激活 NF－κB蛋白激酶(IKK)和有絲分裂原激活蛋白激酶(MKK)復(fù)合物后，IκB 磷酸化使 NF－κB 移位至核內(nèi)，刺激炎癥性細(xì)胞因子產(chǎn)生，觸發(fā)天然免疫反應(yīng)，最終引起獲得性細(xì)胞免疫反應(yīng)以促進(jìn)病原體的清除。NF－κB是一種多效應(yīng)轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)強(qiáng)弱的核心［15］。本實(shí)驗(yàn)中大鼠腹腔注射表皮葡萄球菌后，腹膜組織NF－κB表達(dá)明顯增多;此外，表皮葡萄球菌刺激3h后，大鼠腹膜組織TNF－α顯著激活，并持續(xù)至24h。TNF－α 是 TLR 和 NF－κB信號(hào)通路中的下游重要炎性因子，也是腹膜炎的特征性細(xì)胞因子之一。TNF－α一方面對(duì)保護(hù)性免疫起著關(guān)鍵性的作用，體內(nèi)適量的TNF－α對(duì)機(jī)體抗感染有一定的保護(hù)作用;另一方面，TNF－α還是一種多效性的細(xì)胞因子，分泌過多時(shí)可致瀑布效應(yīng)使炎癥加重，同時(shí)激活的NF－κB及下游炎性因子TNF－α可促進(jìn)TLR2和TLR6的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，形成TLR的自身循環(huán)。所以有必要對(duì)炎癥反應(yīng)進(jìn)行適當(dāng)?shù)目刂疲?6］。Margetts等［17］用腺病毒介導(dǎo)的IL－1β基因與 TNF－α基因轉(zhuǎn)染至大鼠腹腔，可致明顯的腹膜炎癥及纖維化。

姜黃素是姜黃中提取的一種植物多酚，是其發(fā)揮藥理作用最重要的活性成分。近年的研究證實(shí)姜黃素具有抗炎、抑菌、抗氧化、清除氧自由基、保護(hù)肝臟和腎臟、抗纖維化以及防癌抗癌等作用。本研究證實(shí)姜黃素可下調(diào)表皮葡萄球菌誘導(dǎo)的大鼠腹膜炎癥過程中TLR2，TLR6以及NF－κB的過表達(dá)。既往研究證實(shí)，姜黃素作為過氧化物酶增生物激活受體(PPAR)表型之一的 PPAR－γ激動(dòng)劑可通過抑制NF－κB 途徑來抑制炎癥反應(yīng)［17］。PPAR－γ 可直接與NF－κB的亞基p65/p50結(jié)合，發(fā)生蛋白質(zhì)－蛋白質(zhì)相互作用，形成轉(zhuǎn)錄抑制復(fù)合物，降低了 NF－κB與DNA結(jié)合活性，抑制NF－κB的DNA合成，從而抑制其表達(dá)［18］。有研究表明，姜黃素能夠降低急性胰腺炎過程中TNF－α的表達(dá)和下調(diào)炎癥介質(zhì)的釋放，進(jìn)而減輕胰腺組織損傷和系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)［19］。本研究結(jié)果提示，在表皮葡萄球菌誘導(dǎo)的急性大鼠腹膜炎中TNF－α的表達(dá)明顯上調(diào)，而姜黃素能夠有效抑制TNF－α的過表達(dá)，對(duì)TLR具有負(fù)性調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而減輕腹膜的炎癥反應(yīng)。

小結(jié):本實(shí)驗(yàn)證實(shí)，在表皮葡萄球菌誘發(fā)的急性腹膜炎過程中，姜黃素在基因水平抑制了TLR2和TLR6的表達(dá)，同時(shí)下調(diào)NF－κB及其下游炎癥因子TNF－α的表達(dá)，減輕腹膜組織損傷。本研究提示姜黃素在表皮葡萄球菌誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)中起到一定的保護(hù)作用，為PD相關(guān)腹膜炎及腹膜纖維化的防治提供了新思路。

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