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    黃芩素對(duì)乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移的影響及其相關(guān)機(jī)制

    2021-06-19 08:27:16裴曉東孫占勇陳世軍
    關(guān)鍵詞:素處理黃芩載體

    裴曉東,孫占勇,陳世軍

    (鄭州市第一人民醫(yī)院普外科,河南 鄭州 450000)

    乳腺癌是女性發(fā)病率較高的惡性腫瘤之一,嚴(yán)重威脅女性的生命健康,目前乳腺癌發(fā)病率逐年升高且呈低齡化趨勢(shì)[1-2]。據(jù)全球流行病統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示,2012年全球約有170萬乳腺癌新發(fā)病例,并有521 900例患者病死[3]。雖然近年來針對(duì)乳腺癌的篩查及放射治療、化學(xué)治療等手段有了長(zhǎng)足進(jìn)步,但乳腺癌的具體發(fā)病機(jī)制和侵襲轉(zhuǎn)移機(jī)制仍不十分清楚,因腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移造成的治療失敗也屢見不鮮。因此,抑制腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移已成為乳腺癌等腫瘤防治研究的焦點(diǎn)之一。黃芩素是一種從唇形科植物黃芩的根莖中提取的有效成分[4]。研究表明,黃芩素具有抗腫瘤、抗炎和抗細(xì)菌感染等生物學(xué)活性,對(duì)心血管疾病也表現(xiàn)出一定的防治作用[5]。ZHAO等[6]研究發(fā)現(xiàn),黃芩素可通過調(diào)控腫瘤相關(guān)的巨噬細(xì)胞極化來抑制乳腺癌的侵襲和轉(zhuǎn)移。YU等[7]研究表明,黃芩素可通過激活長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)PAX8-AS1-N來抑制乳腺癌的生長(zhǎng)。lncRNA是一類長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸且不能編碼蛋白質(zhì)的RNA,可參與調(diào)控多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。轉(zhuǎn)移相關(guān)肺腺癌轉(zhuǎn)錄本1(metastasisassociated lung adenocarcinoma transcript 1,MALAT1)是一種在腫瘤組織中高表達(dá)的lncRNA[8];有研究證實(shí),MALAT1可促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移,并導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞耐藥[8-9]。基于此,本研究通過檢測(cè)黃芩素處理后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力和侵襲能力的變化,進(jìn)一步探討黃芩素對(duì)乳腺癌侵襲、轉(zhuǎn)移的作用;并通過觀察黃芩素處理后人乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelialmesenchymal transition,EMT)標(biāo)志物上皮型鈣黏蛋白(cadherin 1,CDH1)、蝸牛家族轉(zhuǎn)錄抑制因子1(snail family transcriptional repressor,SNAIL)、波形蛋白(vimentin)表達(dá)水平以及MALAT1 mRNA表達(dá)變化,探討其分子生物學(xué)機(jī)制;旨在為臨床應(yīng)用黃芩素治療乳腺癌提供依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞、試劑與儀器人乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231購自上海中國科學(xué)院細(xì)胞庫。實(shí)驗(yàn)用黃芩素(CAS 491-67-8,貨號(hào)465119-100MG)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)購自美國Sigma公司,RPMI-1640培養(yǎng)基和胎牛血清購自美國Gibco公司,放射免疫沉淀法(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、結(jié)晶紫染色液購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司,甲醇(分析純)購自北京國藥化學(xué)試劑有限公司,CDH1、SNAIL、vimentin一抗購自美國Abcam公司,辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠免疫球蛋白(immunoglobulin,Ig)G二抗和內(nèi)參β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)一抗購自北京中杉金橋公司,pcDNA3.1載體為本實(shí)驗(yàn)室保存,聚偏二氟乙烯(polyvinylidene difluoride,PVDF)膜購自美國Millipore公司,轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine 2000購自美國Life公司,二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量試劑盒、增強(qiáng)型電化學(xué)發(fā)光液(enhanced chemical luminescence,ECL)、TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR Green Master Mix染料購自美國ThermoFisher公司;熒光倒置顯微鏡購自德國Zeiss公司,細(xì)胞培養(yǎng)箱、7500型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction,PCR)儀購自美國ThermoFisher公司,蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)電泳裝置購自北京六一儀器廠,天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)購自上海天能科技有限公司。

    1.2 實(shí)驗(yàn)方法

    1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)將MDA-MB-231細(xì)胞接種于含體積分?jǐn)?shù)10%胎牛血清、1×105U·L-1青霉素和100 mg·L-1鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基中,置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng),培養(yǎng)48 h后收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

    1.2.2 劃痕愈合實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞,按每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L-1黃芩素溶液,置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞生長(zhǎng)至鋪滿培養(yǎng)皿底部時(shí),使用10μL的無菌吸頭劃過細(xì)胞表面,使用預(yù)熱的磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline,PBS)清洗2遍,將殘余的細(xì)胞碎片洗去,繼續(xù)置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。分別于0、24 h時(shí)使用倒置顯微鏡拍照,應(yīng)用Image J軟件測(cè)量劃痕寬度,并計(jì)算細(xì)胞轉(zhuǎn)移率。細(xì)胞轉(zhuǎn)移率=(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

    1.2.3 Transwell小室實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞,隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組,分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L-1黃芩素溶液干預(yù)12 h,隨后進(jìn)行Transwell小室實(shí)驗(yàn)。取干預(yù)12 h的各組細(xì)胞,每孔2.5×105個(gè)細(xì)胞接種于預(yù)鋪基質(zhì)膠的小室中,將小室置于24孔板中,上室使用含體積分?jǐn)?shù)1%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,下室使用含體積分?jǐn)?shù)15%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于培養(yǎng)箱中孵育24 h,隨后取出小室并使用PBS清洗3次,甲醇固定30 min,結(jié)晶紫染色30 min。染色結(jié)束后使用細(xì)胞刮刀將上室中的細(xì)胞輕輕刮下,PBS潤洗2次,將刮下的上室細(xì)胞收集于干凈的1.5 mL離心管中。PBS清洗后的小室置于顯微鏡下拍照,然后使用冰醋酸洗脫黏附在下室的細(xì)胞,使用酶標(biāo)儀檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm處下室洗脫細(xì)胞的吸光度值,將洗脫的上室細(xì)胞合并至下室細(xì)胞中再次測(cè)量吸光度值,并計(jì)算侵襲率。侵襲率=下室洗脫細(xì)胞的吸光度值/上室細(xì)胞合并至下室細(xì)胞后的吸光度值×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

    1.2.4 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)各組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞,按每孔8×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組,分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L-1黃芩素溶液,置于37℃、含體積分?jǐn)?shù)5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后,使用50μL RIPA裂解液裂解細(xì)胞并提取細(xì)胞總蛋白,取2μL裂解液上清蛋白樣品使用BCA法測(cè)定蛋白濃度。取30 mg樣品蛋白,使用聚丙烯酰胺凝膠電泳、PVDF轉(zhuǎn)膜后,使用50 g·L-1的脫脂牛奶室溫封閉1 h,分別加入β-actin、CDH1、SNAIL和vimentin一抗(稀釋比例均為1∶1 000),于4℃下孵育過夜,使用1×TBST洗膜3次,每次10 min,洗去一抗后,加入辣根酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG二抗(稀釋比例1∶5 000),于37℃下孵育30 min,1×TBST洗膜3次,每次10 min,使用ECL發(fā)光液顯影,天能化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)采集圖像,Image J圖像分析軟件測(cè)定蛋白質(zhì)條帶灰度值,以目的蛋白灰度值與內(nèi)參蛋白(β-actin)灰度值比值表示蛋白相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次,取均值。

    1.2.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)各組細(xì)胞中MALAT1 mRNA表達(dá)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞,以每孔5×105個(gè)細(xì)胞接種于6孔板中,隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L-1黃芩素溶液,培養(yǎng)48 h后棄掉培養(yǎng)基,PBS清洗細(xì)胞2遍,隨后各組細(xì)胞中加入1 mL TRIzol試劑,根據(jù)試劑盒說明提取總RNA。取1μg總RNA根據(jù)反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA模板,反轉(zhuǎn)錄條件為42℃維持30 min,95℃維持2 min,cDNA模板保存于-20℃冰箱。采用qRT-PCR法檢測(cè)MALAT1 mRNA表達(dá)。MALAT1上游引物序列為5′-GGATCCTAGACCAGCATGCC-3′,下游引物序列為5′-AAAGGTTACCATAAGTAAGTTCCAGAAAA-3′;甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)上游引物序列為5′-GTCTCCTCTGACTTCAACAGCG-3′,下游引物序列為5′-ACCACCCTGTTGCTGTAGCCAA-3′。根據(jù)SYBR GREEN染料試劑盒說明書以cDNA模板為底物進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)體系總體積為15μL,其中上下游引物共1μL(10μmol·L-1),cDNA模板1μL(200 ng),SYBR GREEN染料5.5μL和水7.5μL。擴(kuò)增循環(huán)條件為95℃變性5 min,60℃退火30 s,72℃延伸20 s,循環(huán)45次;以GAPDH為內(nèi)參,根據(jù)2-ΔΔCt法計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。

    1.2.6 MALAT1過表達(dá)載體的構(gòu)建在PubMed數(shù)據(jù)庫中獲得MALAT1基因mRNA序列,以此為模板設(shè)計(jì)PCR引物,并在引物兩端引入限制性酶切位點(diǎn)Bam H1和HindⅢ。PCR擴(kuò)增獲得MALAT1 mRNA產(chǎn)物。過表達(dá)載體構(gòu)建使用的MALAT1 mRNA-序列的上游引物序列為5′-CTAGCTAGCGCTTACAATCTTAGAGTGGTAGGCA-3′,下游引物序列為5′-CCGCTCGAGTCTAACATAGTTCAACCCACCAAAG-3′。雙酶切pcDNA3.1載體和MALAT1 PCR產(chǎn)物,根據(jù)限制性內(nèi)切酶說明書配制反應(yīng)體系,酶切過夜,獲得其線性片斷,使用T4 DNA連接酶將MALAT1 mRNA序列與酶切后的載體相連,并轉(zhuǎn)化至感受態(tài)大腸桿菌中進(jìn)行擴(kuò)增。利用載體的氨芐青霉素抗性篩選出轉(zhuǎn)化大腸桿菌陽性克隆并測(cè)序,測(cè)序結(jié)果正確的克隆用于提取過表達(dá)載體并保存菌種。

    1.2.7 細(xì)胞轉(zhuǎn)染及過表達(dá)MALAT1細(xì)胞中CDH1、vimentin、SNAIL蛋白和SNAIL mRNA表達(dá)檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期MDA-MB-231細(xì)胞,按每孔5×105的密度接種于6孔板中,隨機(jī)分為對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,分別加入終濃度0、20、40、80、160μmol·L-1黃芩素溶液,待細(xì)胞匯合度約為65%時(shí),更換為不含血清和抗生素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)4 h。按Lipofectamine 2000說明書配制轉(zhuǎn)染試劑和pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)質(zhì)粒(2μg)混合液,其中轉(zhuǎn)染試劑與質(zhì)粒體積比為2∶1,室溫靜置20 min后滴加至6孔板中,每孔500μL,將6孔板置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h,應(yīng)用蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白表達(dá),方法同“1.2.4”;實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)MALAT1 mRNA表達(dá)量,方法同“1.2.5”。

    1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析,組間兩兩比較采用Student-Newman-Keuls(SNK)法,P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    2.1 5組MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移率比較對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組MDA-MB-231細(xì)胞轉(zhuǎn)移率分別為(91.23±2.12)%、(75.34±1.30)%、(66.42±5.03)%、(42.01±2.37)%、(29.38±6.01)%。20μmol·L-1黃芩素處理組和40μmol·L-1黃芩素處理組與對(duì)照組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);80μmol·L-1黃芩素處理組和160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。80μmol·L-1黃芩素處理組和160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率低于20μmol·L-1黃芩素處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞轉(zhuǎn)移率低于80μmol·L-1黃芩素處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各劑量黃芩素處理組之間細(xì)胞轉(zhuǎn)移率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.2 5組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲率的比較結(jié)果見圖1。對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處組MDA-MB-231細(xì)胞侵襲率分別為(102.19±1.35)%、(81.34±2.08)%、(76.41±4.21)%、(52.42±4.02)%、(35.33±2.11)%。20μmol·L-1黃芩素處理組和40μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞侵襲率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05);80μmol·L-1黃芩素處理組和160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞侵襲率低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞侵襲率低于20μmol·L-1黃芩素處理組和40μmol·L-1黃芩素處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其余各劑量黃芩素處理組之間細(xì)胞侵襲率比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖1 5組MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲能力(結(jié)晶紫染色,×200)Fig.1 Migration of MDA-MB-231 cells in the five groups(crystal violet staining,×200)

    2.3 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖2和表1。20μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。40μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);CDH1和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。80μmol·L-1黃芩素處理組和160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于對(duì)照組和20μmol·L-1黃芩素處理組,vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組和20μmol·L-1黃芩素處理組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1蛋白相對(duì)表達(dá)量高于40μmol·L-1黃芩素處理組,vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量低于40μmol·L-1黃芩素處理組,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。其余各劑量黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖2 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白的表達(dá)Fig.2 Expression of CDH1,SNAIL and vimentin protein in MDA-MB-231 cells in the five groups

    表1 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of relative expression of CDH1,SNAIL and vimentin protein in MDA-MB-231 cells among the five groups(±s)

    表1 5組MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.1 Comparison of relative expression of CDH1,SNAIL and vimentin protein in MDA-MB-231 cells among the five groups(±s)

    注:與對(duì)照組比較a P<0.05;與20μmol·L-1黃芩素處理組比較b P<0.05;與40μmol·L-1黃芩素處理組比較c P<0.05。

    組別n CDH1 vimentin SNAIL對(duì)照組0.12±0.11 0.87±0.03 0.92±0.06 20μmol·L-1黃芩素處理組3 0.22±0.02 0.72±0.12 0.81±0.05 40μmol·L-1黃芩素處理組3 0.36±0.05 0.64±0.13 0.69±0.10a 80μmol·L-1黃芩素處理組3 0.45±0.02ab 0.42±0.05ab 0.51±0.03ab 160μmol·L-1黃芩素處理組3 0.59±0.03abc 0.28±0.08abc 0.38±0.04 abc

    2.4 5組MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較對(duì)照組和20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.01±0.02、0.81±0.03、0.72±0.05、0.48±0.05和0.39±0.04。20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。80μmol·L-1黃芩素處理組和160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于20μmol·L-1黃芩素處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量低于40μmol·L-1黃芩素處理組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05);其余各劑量黃芩素處理組細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    2.5 5組過表達(dá)pcDNA 3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA及CDH1、SNAIL、vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較結(jié)果見圖3和表2。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體MDA-MB-231細(xì)胞和轉(zhuǎn)染空載體MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為13.93±0.02、0.98±0.02,轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT mRNA相對(duì)表達(dá)量高于轉(zhuǎn)染空載體MDA-MB-231細(xì)胞,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05),說明過表達(dá)載體構(gòu)建成功并在MDA-MB-231細(xì)胞中表達(dá)。轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-MALAT1過表達(dá)載體后,20、40、80、160μmol·L-1黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。不同劑量黃芩素處理組細(xì)胞中CDH1、vimentin和SNAIL蛋白相對(duì)表達(dá)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

    圖3 5組過表達(dá)pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白的表達(dá)Fig.3 Expression of CDH1,SNAIL and vimentin protein in overexpressing pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231 cells in the five groups

    表2 5組過表達(dá)載體pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of CDH1,SNAIL and vimentin protein in overexpressing pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231 cells among the five groups(±s)

    表2 5組過表達(dá)載體pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231細(xì)胞中CDH1、SNAIL和vimentin蛋白相對(duì)表達(dá)量的比較Tab.2 Comparison of relative expression of CDH1,SNAIL and vimentin protein in overexpressing pcDNA3.1-MALAT1 MDA-MB-231 cells among the five groups(±s)

    組別n CDH1 vimentin SNAIL對(duì)照組0.18±0.12 0.82±0.04 0.89±0.04 20μmol·L-1黃芩素處理組3 0.21±0.05 0.78±0.10 0.81±0.03 40μmol·L-1黃芩素處理組3 0.28±0.04 0.84±0.11 0.79±0.12 80μmol·L-1黃芩素處理組3 0.23±0.01 0.72±0.04 0.81±0.05 160μmol·L-1黃芩素處理組3 0.24±0.02 0.76±0.09 0.83±0.03

    3 討論

    乳腺癌是女性最常見的惡性腫瘤之一,全球每年約210萬女性確診罹患乳腺癌[1]。雖然目前對(duì)于乳腺癌的診斷和治療手段有了明顯進(jìn)步,但是乳腺癌患者的預(yù)后一直不太理想。有研究報(bào)道,我國3%~10%的乳腺癌患者在確診時(shí)已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移,5 a生存率約為20%[10]。乳腺癌細(xì)胞的惡性侵襲、轉(zhuǎn)移是影響乳腺癌患者預(yù)后的一個(gè)重要原因[11]。關(guān)于腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移的研究已成為醫(yī)學(xué)領(lǐng)域重點(diǎn)關(guān)注的課題之一。研究證實(shí),lncRNA等分子能夠通過調(diào)控多種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與調(diào)控多種癌癥包括乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展以及侵襲和轉(zhuǎn)移過程[12-14],這為乳腺癌的診斷和治療提供了新的思路或靶點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn),一些天然產(chǎn)物可抑制乳腺癌的發(fā)生發(fā)展,例如補(bǔ)骨脂異黃酮、假白欖酮和黨參內(nèi)酯等均表現(xiàn)出抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用[15-17]。但天然產(chǎn)物發(fā)揮抗腫瘤作用的機(jī)制,尤其是其與lncRNA調(diào)控有關(guān)的分子機(jī)制仍不明確,需要進(jìn)一步研究。

    黃芩素為一種從植物中提取的活性物質(zhì),具有良好的抗腫瘤活性[7,18-19]。研究表明,黃芩素可通過不同的分子生物學(xué)機(jī)制對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖、侵襲及轉(zhuǎn)移發(fā)揮抑制作用[7-9]。KOH等[20]研究表明,黃芩素可以上調(diào)干擾素誘導(dǎo)的三角形四肽重復(fù)蛋白2并抑制MDA-MB-231細(xì)胞的腫瘤干細(xì)胞特征,從而發(fā)揮提高化學(xué)治療敏感性的作用。YAN等[21]研究發(fā)現(xiàn),黃芩素能夠抑制乳腺癌細(xì)胞中磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,促進(jìn)乳腺癌細(xì)胞的凋亡和自噬。EMT被認(rèn)為是驅(qū)動(dòng)腫瘤轉(zhuǎn)移發(fā)生的第1步。EMT直接受轉(zhuǎn)錄因子例如SNAIL的驅(qū)動(dòng)[22],而CDH1和vimentin則充當(dāng)EMT效應(yīng)器的角色,調(diào)控細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的變化。CDH1蛋白水平下降,SNAIL蛋白和vimentin蛋白水平升高被認(rèn)為是細(xì)胞發(fā)生EMT的標(biāo)志[23]。JADALIHA等[9]研究表明,黃芩素可通過抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路抑制乳腺癌細(xì)胞的EMT過程。NGUYEN等[24]研究表明,黃芩素可通過下調(diào)富含半胱氨酸蛋白61和賴氨酰氧化酶樣蛋白2的表達(dá)抑制乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞的EMT過程。以上研究說明黃芩素具有潛在的抑癌生物活性,可對(duì)乳腺癌的侵襲、轉(zhuǎn)移起抑制作用。MALAT1是一種促癌非編碼RNA,參與多種腫瘤的生成、代謝及血管生成等[25]。MALAT1能夠通過競(jìng)爭(zhēng)性內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)參與調(diào)控多種促癌基因的表達(dá),如MALAT1可競(jìng)爭(zhēng)性地結(jié)合miR-26a,使靶向轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β2(transforming growth factor beta 2,TGF-β2)的內(nèi)源miR-26a減少,從而上調(diào)TGF-β2的表達(dá)水平并促進(jìn)細(xì)胞的EMT過程[26]。因此,以MALAT1為靶標(biāo)尋找潛在的抑制劑具有較完善的理論支持和廣闊前景。

    雖然目前對(duì)黃芩素抑制乳腺癌細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移及EMT的作用的報(bào)道較多,但其具體涉及的分子生物學(xué)機(jī)制并不明確?;诖?,本研究使用梯度濃度的黃芩素處理乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞,結(jié)果顯示,黃芩素可抑制MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移能力,降低EMT過程中間充質(zhì)標(biāo)志物vimentin和SNAIL蛋白水平,上調(diào)CDH1蛋白表達(dá);高濃度的黃芩素抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的效果強(qiáng)于低濃度黃芩素,對(duì)EMT標(biāo)志物蛋白水平的影響更顯著。此外,本研究結(jié)果還顯示,黃芩素可顯著抑制MDA-MB-231細(xì)胞中MALAT1 mRNA的表達(dá)水平,過表達(dá)MALAT1后可逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)EMT過程的抑制作用。以上結(jié)果證實(shí),黃芩素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移具有顯著的抑制作用,且該作用與黃芩素的濃度有關(guān),即高濃度黃芩素對(duì)侵襲、轉(zhuǎn)移的抑制效果更明顯;黃芩素通過影響MDA-MB-231細(xì)胞中間充質(zhì)標(biāo)志物vimentin和SNAIL蛋白以及上皮標(biāo)志物CDH1蛋白表達(dá)水平,參與調(diào)控EMT過程,進(jìn)而發(fā)揮抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用,而MALAT1可逆轉(zhuǎn)黃芩素對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞EMT過程的抑制作用。

    綜上所述,黃芩素可通過抑制lncRNA MALAT1發(fā)揮抑制MDA-MB-231細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移的作用,這為探索黃芩素生物學(xué)功能潛在的分子生物學(xué)機(jī)制提供了新思路。根據(jù)MALAT1及其他lncRNA的作用特點(diǎn),推測(cè)黃芩素抑制MALAT1表達(dá)后可通過競(jìng)爭(zhēng)內(nèi)源RNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)促進(jìn)其相關(guān)靶向的微RNA表達(dá),進(jìn)而抑制潛在的下游促癌靶基因并抑制乳腺癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移,但需要后續(xù)研究進(jìn)行驗(yàn)證。

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