流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD55、CD59對(duì)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿診斷價(jià)值的探討

邢超　陳慧　楊軍軍　王鄭　郭文堅(jiān)

[摘要] 目的 探討患者外周血細(xì)胞膜上CD55和CD59缺陷對(duì)陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（paroxysmal nocturnal hemoglobinuria，PNH）的診斷價(jià)值。 方法 采用流式細(xì)胞術(shù)對(duì)CD55-PE及CD59-FITC標(biāo)記的患者外周血中性粒細(xì)胞和紅細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)。對(duì)2009年1月～2012年3月來(lái)我院就診的13例PNH患者、13例再生障礙性貧血（aplastic anemia，AA）、21例骨髓增生異常綜合征（myelodysplastic syndromes，MDS）患者、12例缺鐵性貧血（irondeficient anemia，IDA）患者與同期80例健康體檢者進(jìn)行回顧性分析。 結(jié)果 PNH患者中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞膜表面CD55、CD59較AA、MDS、IDA及健康體檢者均明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。 結(jié)論 利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)貧血患者外周血紅細(xì)胞及中性粒細(xì)胞膜上CD55和CD59缺陷，是臨床鑒別診斷PNH與AA、IDA、MDS可靠而敏感的指標(biāo)。

[關(guān)鍵詞] 流式細(xì)胞術(shù)；CD55；CD59；陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿

[中圖分類號(hào)] R446.11[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B[文章編號(hào)] 1673-9701（2012）29-0079-02

陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿（PNH）是獲得性細(xì)胞膜缺陷引起的一種溶血性貧血，與再障關(guān)系密切，可相互轉(zhuǎn)變。發(fā)病時(shí)可表現(xiàn)為貧血、血紅蛋白尿、感染及血栓形成[1]。近年來(lái)，流式技術(shù)日漸成熟，利用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血中紅細(xì)胞與粒細(xì)胞表面CD55和CD59是目前絕大多數(shù)實(shí)驗(yàn)室診斷PNH的首選方法，較傳統(tǒng)檢測(cè)方法敏感性高且方便。本文采用流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometre，F(xiàn)CM）對(duì)于59例貧血患者的外周血細(xì)胞CD55、CD59缺失率進(jìn)行檢測(cè)，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

對(duì)2009年1月～2012年3月來(lái)本院及一附醫(yī)就診的貧血患者共59例進(jìn)行回顧性分析，其中PNH患者（A組）13例，男9例，女4例，平均年齡（48.3±11.8）歲；MDS患者（B組）21例，男15例，女6例，平均年齡（67.4±12.8）歲；AA患者（C組）13例，男11例，女2例，平均年齡（30.2±22.4）歲；IDA患者（D組）12例，男5例，女7例，平均年齡（44.5±20.2）歲；同期正常體檢或無(wú)貧血相關(guān)疾病患者（E組）80例，男42例，女38例，平均年齡（45.2±10.5）歲。

1.2 PNH診斷標(biāo)準(zhǔn)

（1）臨床表現(xiàn)符合PNH；（2）實(shí)驗(yàn)室檢查：酸化血清溶血試驗(yàn)（Ham試驗(yàn)）、糖水試驗(yàn)、蛇毒因子溶血試驗(yàn)、尿潛血或尿含鐵血黃素試驗(yàn)中凡符合下述任何一種情況，即可診斷。①二項(xiàng)以上陽(yáng)性；②一項(xiàng)陽(yáng)性，但須具備以下條件：（a）兩次以上陽(yáng)性，或一次陽(yáng)性，但操作正規(guī)，有陰性對(duì)照，（b）有溶血證據(jù)，（c）能排除其他溶血，如G6PD缺乏所致溶血、自身免疫性溶血性貧血等[2]。

1.3 結(jié)果判讀

以健康體檢者紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55、CD59表達(dá)設(shè)定陰性閾值，CD55、CD59百分率減少大于10%認(rèn)定為PNH陽(yáng)性，減少5%～10%為可疑陽(yáng)性。

1.4 試驗(yàn)方法

所有病例均采用流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行紅細(xì)胞和粒細(xì)胞膜上CD55和CD59檢測(cè)。流式細(xì)胞儀為BD公司FACS CantoⅡ，所有試劑均購(gòu)自BD公司。

1.4.1 中性粒細(xì)胞熒光抗體標(biāo)記取患者及同期健康對(duì)照者肝素抗凝血各100μL，加入1×BD紅細(xì)胞溶血素1 mL，15 min后溶血，棄上清，加入3 mL PBS緩沖液混勻后500 g離心5 min，棄上清，加入CD59-FITC、CD55-PE及同型對(duì)照各20 μL，避光反應(yīng)30 min，加入PBS 400μL，待上機(jī)檢測(cè)。

1.4.2 紅細(xì)胞熒光抗體標(biāo)記取患者及同期健康對(duì)照者肝素抗凝血各20 μL，加入2 mL PBS緩沖液混勻，各取20 μL加入BD專用流式管中，分別加入CD59-FITC、CD55-PE及同型對(duì)照各20 μL，避光反應(yīng)30 min，加入PBS 400 μL，待上機(jī)檢測(cè)。

1.4.3 流式細(xì)胞儀校正取標(biāo)準(zhǔn)熒光微球各數(shù)滴（BD公司提供），加1 mL PBS稀釋、混勻，上機(jī)調(diào)整電壓及補(bǔ)償。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS13.0軟件分析，組間計(jì)量資料的比較采用方差檢驗(yàn)，以P < 0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

PNH患者中性粒細(xì)胞CD55陽(yáng)性率較MDS、AA、IDA及正常對(duì)照組均明顯減少，P < 0.05，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PNH患者中性粒細(xì)胞CD59陽(yáng)性率較MDS、AA、IDA及正常對(duì)照組均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

PNH患者紅細(xì)胞CD55陽(yáng)性率較MDS、AA、IDA及正常對(duì)照組相比均明顯減少，P < 0.05，差別均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；PNH患者血紅細(xì)胞CD59陽(yáng)性率較MDS、AA、IDA及正常對(duì)照組相比均明顯減少，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05）。

MDS組患者中性粒細(xì)胞及紅細(xì)胞表面CD55和CD59陽(yáng)性率分別與AA組、IDA組及Normal組比較，無(wú)明顯變化，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均>0.05）。見(jiàn)表1，圖1～4。

表1PNH、MDS、AA、IDA組與Normal組血細(xì)胞CD55、CD59陽(yáng)性率（%）

注：P1：A與B、C、D和E比較；P2：B與C比較；P3：B與D比較；P4：B與E比較

3 討論

PNH是一種特殊的獲得性造血干細(xì)胞克隆性疾病。近年來(lái)的研究證實(shí)，位于X染色體上的磷脂酰肌醇聚糖-A（PIG-A）基因發(fā)生體細(xì)胞水平的突變[3]，α1-6-N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶功能受到影響，進(jìn)而糖基化磷脂酰肌醇（GPI）合成障礙，導(dǎo)致血液細(xì)胞膜表面多種錨定蛋白缺失，如衰變加速因子（CD55）和反應(yīng)性溶血膜抑制物（CD59），這些可以抵抗補(bǔ)體作用的補(bǔ)體調(diào)節(jié)蛋白的缺失是導(dǎo)致PNH發(fā)病的關(guān)鍵所在。發(fā)生PIG-A基因突變的造血干細(xì)胞再分化和分裂過(guò)程中具有增殖優(yōu)勢(shì)而形成的具有體細(xì)胞突變和GPI錨定蛋白缺失為特征的細(xì)胞群，簡(jiǎn)稱PNH克隆[4]。PNH患者必然存在PNH克隆，但PNH克隆也存在于其他骨髓增殖異常疾病。再生障礙性貧血（AA）、骨髓增生異常綜合征（MDS）等骨髓增生異常疾病患者體內(nèi)也可檢測(cè)到PNH克隆的存在，因此這也是導(dǎo)致PNH與AA具有某些相似癥狀的原因[5，6]。

本文通過(guò)對(duì)59例貧血患者外周血細(xì)胞CD55、CD59陽(yáng)性表達(dá)率檢測(cè)，表明PNH患者CD55、CD59陽(yáng)性表達(dá)率明顯降低，尤其是在中性粒細(xì)胞膜上，其CD55陽(yáng)性率僅約為52.5%，CD59陽(yáng)性率約為56.4%，但在紅細(xì)胞中其陽(yáng)性率分別為67.3%和71.8%。提示患者中外周血中性粒細(xì)胞CD59缺陷細(xì)胞比例高于紅細(xì)胞。有學(xué)者認(rèn)為粒細(xì)胞壽命短，更新快，測(cè)定值主要反映自身造血產(chǎn)出細(xì)胞的情況，受輸血影響小，其表面CD59的表達(dá)較為穩(wěn)定，因而外周血中性粒細(xì)胞CD59的表達(dá)更能反映骨髓中PNH克隆的情況。而在AA患者中可見(jiàn)其也有CD55、CD59的缺失，有個(gè)別患者陽(yáng)性率<95%，但不超過(guò)90%，提示疾病可能有進(jìn)行性變化，有PNH克隆細(xì)胞的存在，但仍以正常細(xì)胞為主。MDS患者的外周血細(xì)胞中CD55、CD59有缺失，其中可見(jiàn)有5例患者缺失率<95%，1例<90%，提示患者存在PNH克隆細(xì)胞，今后有概率發(fā)展為PNH或PNH-MDS綜合征，有待進(jìn)一步觀察。

綜上，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)患者外周血細(xì)胞CD55、CD59可作為PNH診斷指標(biāo)，但在AA、IDA、MDS患者細(xì)胞上均有不同程度的改變，與曹文俊[7]報(bào)道結(jié)果一致。因而對(duì)于AA、MDS有著一定的監(jiān)測(cè)意義，故建議把流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)紅細(xì)胞與粒細(xì)胞膜的CD55、CD59的表達(dá)作為PNH的早期診斷檢測(cè)項(xiàng)目，并作為PNH、AA、MDS患者長(zhǎng)期監(jiān)測(cè)指標(biāo)之一，對(duì)于其臨床診斷與預(yù)后都有著極其重要的應(yīng)用價(jià)值。

[參考文獻(xiàn)]

[1]王永才. 血液骨髓細(xì)胞檢驗(yàn)學(xué)[M]. 大連：大連出版社，1995：2-10.

[2]張志南.血液病診斷及療效標(biāo)準(zhǔn)[M]. 第2版. 北京：科學(xué)出版社，1998：88-96.

[3]俞秋興，單衛(wèi)民，朱永新，等. AA、MDS、PNH患者CD55、CD59檢測(cè)的臨床價(jià)值[J]. 臨床檢驗(yàn)雜志，2002：175-176.

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[5]Azenishi Y，Ueda E，Machii T，et al. CD59-deficiant blood cel1s and PIG-A gene abnormalities in Japanese patients with aplastic anaemia[J].Br J Haematol，1999，104：523-529.

[6]Dunn DE，Tanawattanacharoen P，Boccun IP，et al. Paroxysmal nocturnal hemoglobinuria cells in patients with bone marrow failure syndromes[J].Ann Intern Med，1999，131：401-408.

[7]曹文俊. CD55/CD59缺陷檢測(cè)及其在陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿診斷中的意義[J]. 診斷學(xué)理論與實(shí)踐，2004，3（6）：416-419.

（收稿日期：2012-06-25）