大鼠腦組織中甲狀腺素受體THRα1的表達與阿爾茨海默病的發(fā)病機制

頡賓芳孫雯雯劉卉王佳冰劉昕

·論 著·

大鼠腦組織中甲狀腺素受體THRα1的表達與阿爾茨海默病的發(fā)病機制

頡賓芳*孫雯雯*劉卉△王佳冰*劉昕*

目的觀察大鼠大腦皮層和海馬區(qū)腦組織中甲狀腺素受體THRα1的表達與阿爾茨海默病發(fā)生的相關(guān)性并對其機制進行初步探討。方法SD大鼠腹腔注射D-半乳糖50 mg·（kg·d）－1，復(fù)制阿爾茨海默病動物模型，另設(shè)正常對照組，腹腔注射等量生理鹽水。連續(xù)給藥6周后觀察動物精神狀態(tài)、活動情況等；取大腦皮層和海馬區(qū)組織制作病理切片，光鏡下觀察其形態(tài)學變化；分別用實時熒光定量PCR（FQ-PCR）法和Westernblot法檢測阿爾茨海默病動物與正常大鼠腦組織中THRα1、CDK-5及p35 mRNA的差異性表達和pser404-tau蛋白的表達水平。結(jié)果與正常對照組相比，阿爾茨海默病模型組動物神情呆滯，反應(yīng)遲鈍，鏡下見大腦皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元排列紊亂，核濃染、固縮，神經(jīng)元軸突染色較深呈拖尾狀，形成神經(jīng)元纖維纏結(jié)，尤以海馬區(qū)表現(xiàn)更為顯著。與對照組相比，模型組皮層區(qū)THRα1、CDK-51和p35 mRNA表達量增加，分別為 （1.20±0.30）、（4.71±0.54）、（2.11±0.40），差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；模型組海馬區(qū)三者的表達量分別為（2.53±0.65）、（18.51±2.7）、（5.96±0.49），與對照組相比亦有統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。模型組pser404-tau蛋白呈高表達狀態(tài)，與正常對照組相比P＜0.05。結(jié)論大腦皮層及海馬區(qū)腦組織中THRα1 mRNA的過表達及由此而加劇的神經(jīng)細胞tau蛋白磷酸化可能參與或促進了大鼠阿爾茨海默病的發(fā)生發(fā)展。

甲狀腺素受體α1 阿爾茨海默病 Tau蛋白磷酸化 細胞周期素依賴性蛋白激酶5

阿爾茨海默病（（Alzheimer disease，AD）是老年人最常見的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病，發(fā)病機制迄今尚未闡明［1－3］。THRα1是腦組織中表達最多的甲狀腺素受體（thyroid hormone receptor，THR）［4－5］。當甲狀腺素與之結(jié)合后，通過甲狀腺素反應(yīng)元件（thyroid hormone response elements，TRE）調(diào)控靶基因的表達［4］，而與腦組織tau蛋白磷酸化水平密切相關(guān)的細胞周期素依賴性蛋白激酶5（cyclin-dependent kinase5，CDK-5）即其靶基因之一。近年有關(guān)甲狀腺激素水平與AD認知功能損害間關(guān)系的研究已有部分報道［6－8］；但THRα1及CDK-5在腦組織中表達水平的變化是否與AD發(fā)生有關(guān)尚未見相關(guān)報道。本實驗擬就此作初步研究。

1 材料

1.1 動物雄性健康SD大鼠40只，體重180～220 g，由湖南斯萊克有限公司實驗動物中心提供（動物許可證號：HNASLKG20100293）。大鼠隨機分籠飼養(yǎng)，自由攝食與飲水，室溫20～22℃，維持每日光照12 h。標準鼠飼料由蘭州大學實驗動物中心提供。

1.2 方法

1.2.1 AD動物模型的復(fù)制 依隨機數(shù)字表法將大鼠分為AD模型組和正常對照組，每組20只。AD模型組腹腔注射D-半乳糖溶液50 mg·（kg·d）－1［9］，正常對照組注射等體積生理鹽水，連續(xù)6周，每周稱重1次，依據(jù)末次稱重的克數(shù)調(diào)整給藥劑量。期間觀察動物一般狀況，如精神、活動、毛發(fā)、飲食等。

1.2.2 腦組織取材及病理切片制作 實驗6周之后，水合氯醛麻醉大鼠，迅速開胸暴露心臟，經(jīng)左心室灌注4℃生理鹽水100 mL快速沖洗，再以預(yù)冷的4%中性多聚甲醛灌注，后迅速斷頭取出大腦皮層及海馬組織，隨機自每組中各取8只制成病理切片，進行HE染色10和改良Bicschowsky染色11，用以觀察腦組織中老年斑、神經(jīng)原纖維纏結(jié)及神經(jīng)元數(shù)量、體積、排列狀況等形態(tài)學變化。剩余組織冷凍于－80℃，用以檢測THRa1、CDK-5和p35 mRNA的表達及pser404-tau蛋白的表達。

1.2.3 大腦皮層及海馬組織中THRa1、CDK-5和p35 mRNA表達的檢測

1.2.3.1 RNA的提取及cDNA的合成 取皮層及海馬部位腦組織各100 mg，按照Trizol Reagent說明書提取總RNA，采用紫外分光光度法對其定量。按M-MuLV First Stand CDNA合成試劑盒說明取2 μL（8 μg）總RNA作為模板，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，－20℃保存。

1.2.3.2 RT-PCR Primer6軟件設(shè)計各引物序列，由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。THRa1：上游5′-CGGAATCAGTGCCAGTTGTGC-3′，下游5′-AGGAGTGGGCTCTGGTCGTTG-3′，擴增片段長度177 bp；CDK-5：上游5′-AGCCTTTGGTATCCCAGTCC-3′，下游5′-CAGTCGGTGTCCCT AGCAGT-3′，擴增片段長度224 bp；p35：上游5′-GAAGCGGCACTCCATCATCT-3′，下游5′-GGACA GGTTGGCACACGACAG-3′，擴增片段長度166 bp。設(shè)β-actin為內(nèi)參照。2%瓊脂糖電泳觀察PCR結(jié)果。

1.2.3.3 SYBR Green FQ-PCR 按試劑盒說明設(shè)置反應(yīng)參數(shù)，檢測各目的基因mRNA表達量，每樣本設(shè)3個平行，溶解曲線程序：94℃10 s，60℃30 s，從67℃～99℃自動繪制溶解曲線圖。實驗重復(fù)3遍。

1.2.4 pser404-tau蛋白表達檢測 取海馬組織100 mg，采用Western-blot法進行檢測，依次加入一抗和辣根過氧化物酶標記的IgG二抗，最后以ECL超敏發(fā)光液顯影成像分析。pser404-tau蛋白表達水平用目的蛋白條帶分別與內(nèi)參照β-actin條帶灰度值之比標示，采用Image-Proplus軟件分析。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 17.0進行統(tǒng)計分析，計量資料以（x±s）表示，兩兩組間比較用t檢驗，檢驗水準α＝0.05。

2 結(jié)果

2.1 一般情況在清醒狀態(tài)下，正常對照組大鼠精神飽滿，反應(yīng)敏捷，皮毛光潔；而模型組動物隨著造模時間的延長，逐漸出現(xiàn)精神差，神情呆滯，反應(yīng)遲鈍，活動減少，被毛無光澤，晦暗不順，食欲減退等。

2.2 腦組織形態(tài)學變化

2.2.1 HE染色 正常對照組神經(jīng)元排列規(guī)則整齊，形態(tài)完整；細胞核大而圓，著色較淺，位于細胞中央。膠質(zhì)細胞的形態(tài)亦正常。AD模型組皮質(zhì)及海馬區(qū)神經(jīng)元細胞數(shù)目減少，細胞排列松散、紊亂，在變性壞死神經(jīng)元周圍出現(xiàn)散在的粉紅色斑塊樣淀粉樣蛋白（圖1）。

2.2.2 改良Bicschowsky染色法 正常對照組海馬結(jié)構(gòu)和神經(jīng)元形態(tài)正常，細胞體未著色，軸突呈棕褐色，神經(jīng)元纖維排列規(guī)則整齊、緊密、形態(tài)完整。AD模型組皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元排列散亂，細胞內(nèi)神經(jīng)原纖維增粗，可見較多胞體和軸突染色較深的神經(jīng)元成拖尾狀，形成NFT（圖2）。

2.3 THRα1、CDK-5和p35 mRNA的表達瓊脂糖凝膠電泳示各基因擴增條帶單一、無雜帶，大小與預(yù)計相符，THRα1、CDK-5、p35、β-actin分別為177、224、166、200 bp（圖3）；SYBR Green FQ-PCR擴增曲線平滑，各基因均有明顯的指數(shù)擴增期（圖4）。設(shè)正常對照組各基因mRNA表達量為1，模型組皮層區(qū)THRα1、CDK-5、p35 mRNA表達量分別為正常對照組的 （1.20±0.30）、（4.71±0.54）、（2.11±0.40），與正常對照組相比，有統(tǒng)計學差異（*P＜0.05）；模型組海馬區(qū)THRα1、CDK-5、p35 mRNA表達量分別為正常對照組的 （2.53±0.65）、（18.51±2.77）、（5.96±0.49），與模型組皮層區(qū)比較，有統(tǒng)計學差異（**P＜0.05）（圖5）。

2.4 Western-blot檢測pser404-tau表達設(shè)正常對照組pser404-tau表達為1，與正常對照組相比較，模型組海馬區(qū)tau蛋白磷酸化位點絲氨酸404磷酸化水平增加至（1.20±0.05），有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（圖6，圖7）。

3 討論

阿爾茨海默病的主要表現(xiàn)是認知與記憶功能逐漸惡化及繼之而來的各種精神癥狀和行為障礙，海馬作為大腦學習記憶的關(guān)鍵部位是AD最早和最易受損的部位。AD的特征性病理變化：一是出現(xiàn)以β-淀粉樣蛋白為主體的老年斑（SP）；二是大腦皮質(zhì)及海馬神經(jīng)元出現(xiàn)大量神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFT），主要成分是高度磷酸化的tau蛋白；三是海馬錐體細胞顆粒空泡變性和膽堿能神經(jīng)損傷、神經(jīng)元缺失等［12－13］，目前的研究多關(guān)注于各種原因引起的腦組織中SP形成在AD發(fā)生發(fā)展中的作用，而細胞內(nèi)tau蛋白的過度磷酸化導致的NFT亦是AD發(fā)生的最重要變化之一。本實驗采用腹腔注射D-半乳糖法復(fù)制AD動物模型，顯微鏡下觀察皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元病理形態(tài)學變化，除見到細胞排列散亂，數(shù)量減少，細胞核固縮濃染及在變性壞死神經(jīng)元周圍有散在的粉紅色斑塊樣淀粉樣蛋白即SP形成等變化之外，實驗還觀察到在皮層和海馬區(qū)腦組織中有神經(jīng)元纖維增粗、排列紊亂呈拖尾狀等變化，即有NFT的形成。

圖1 腦組織形態(tài)學變化（HE，400×）A：正常組皮層區(qū)；B：模型組皮層區(qū)；C：正常組海馬區(qū)；D：模型組海馬區(qū)（箭頭所示：皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元排列散在、紊亂，神經(jīng)元數(shù)目減少，可見大面積的核固縮、核濃染）

圖2 腦組織形態(tài)學變化（銀染，400×）A：正常組皮層區(qū)；B：模型組皮層區(qū)；C：正常組海馬區(qū)；D：模型組海馬區(qū) （箭頭所示：皮層及海馬區(qū)神經(jīng)元細胞內(nèi)神經(jīng)元纖維增粗、排列紊亂成拖尾狀，形成NFT）

圖3 RT-PCR示TRα1、CDK-5、p35、β-actin擴增產(chǎn)物

圖4 SYBR Green實時熒光定量PCR擴增曲線

圖5 各基因mRNA相對表達量①P35；②CDK-5；③THRα1注：與正常對照組比較，*P＜0.05，**P＜0.05

圖6 Western-blot X-光照片①正常對照組；②：模型組

圖7 Western blot檢測各組大鼠海馬區(qū) Pser404-tau表達水平（P＜0.05 vs正常組）

THRα有THRal及THRa2兩類異構(gòu)體，后者為甲狀腺素的非功能受體［14－15］。腦內(nèi)THRα1占全部受體的70～80%，是甲狀腺素的主要功能型受體，參與細胞遷移、髓鞘形成、神經(jīng)元分化等［16］。本實驗觀察到AD動物大腦皮層及海馬區(qū)域THRal表達顯著高于正常對照組大鼠。同時檢測到CDK-5亦呈高表達狀態(tài)。已證明在CDK-5啟動子區(qū)分子結(jié)構(gòu)中存在甲狀腺素反應(yīng)元件。甲狀腺素-受體二聚體可與之特異性結(jié)合影響其下游基因轉(zhuǎn)錄。CDK-5是tau蛋白磷酸化的關(guān)鍵激酶，參與了分裂后神經(jīng)元的靶蛋白磷酸化［17－19］。CDK-5激酶活性依賴于特定的調(diào)節(jié)亞基p35。故實驗尚對比了AD模型組與正常組大鼠大腦皮層和海馬中p35 mRNA 及pser404-tau蛋白的表達。結(jié)果顯示，AD模型組大鼠的海馬及皮層區(qū) THRα1、CDK-5和 p35 mRNA，pser404-tau蛋白表達水平較正常對照組均有顯著提高，尤其是海馬區(qū)。因而，根據(jù)實驗結(jié)果是否可以推測，由于THRα1的異常表達，通過CDK-5分子結(jié)構(gòu)中的TRE，促進了CDK-5 mRNA的表達，在調(diào)節(jié)亞基p35的調(diào)節(jié)下CDK-5激酶活性大大增強，促進了的tau蛋白過度磷酸化，神經(jīng)細胞內(nèi)異常聚集形成神經(jīng)原纖維纏結(jié)，導致微管穩(wěn)定性降低，破壞、解聚，造成神經(jīng)元的功能紊亂和退行性變，最終引起癡呆的發(fā)生。

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An experimental study on the expression of THRα1 in brain tissues in a rat model of Alzheimer’s disease.

XIE Binfang，SUN Wenwen，LIU Hui，WANG Jiabing，LIU Xin.Deparentment of Pathology and Pathophysiology，Basic Medical Science of Lanzhou University，LanZhou 730000，China.Tel：0931－8915023.

ObjectiveTo study the role of thyroid receptor α1（THRα1）in brain tissues in Alzheimer’s disease （AD）.MethodsD-galactose 50 mg·（kg·d）－1was administered by intraperitoneal injection into SD rats to create AD model.Control animals received intraperitoneal injection of the same amount of saline.The mental status and activities were then evaluated six weeks after treatment.Histological analysis was used to examine the morphological changes in the cerebral cortex and hippocampus.Real-time fluorescence quantitative PCR and Western-blot were used to detect the mRNA expression of THRα1，CDK-5 and p35 and protein expression of pser404-tau，respectively.ResultsCompared with control group，AD rats looked sluggish and were unresponsive.In the brain，particularly the hippocampus of AD rats，the neuronal arrangements were disorganized，nuclei were shrunk，and neuronal axons were deeply stained in a tail-like shape， forming neurofibrillary tangles.In AD rats， the mRNA expression levels of THRα1，CDK-5 and p35 were higher in the cortex and hippocampus.In addition，the expression level of pser404-tau protein was significantly higher in AD rats than in control rats（P＜0.05）.ConclusionsThe high level of THR α1 mRNA expression and phosphorylation of protein tau in neurons of the cortex and hippocampus may contribute to the pathological process of AD in rats.

Thyroid hormone receptorα1 Alzheimer's disease Tau phosphorylation CDK-5

R749.1

A

2011－10－31）

（責任編輯：李立）

10.3969／j.issn.1002－0152.2012.09.005

* 蘭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院病理生理學研究所（蘭州 730000）△甘肅省中醫(yī)學院附屬醫(yī)院