微乳液相色譜法同時測定三合平脂膠囊中谷維素與黃連素的含量Δ

石勇，張守堯，張忠義，賀帥（南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院藥劑科，廣州510282）

黃連素與谷維素均為傳統(tǒng)經(jīng)典老藥，臨床應(yīng)用廣泛，近年來藥理學(xué)研究和臨床應(yīng)用[1，2]表明，較大劑量的黃連素和谷維素均具有降低血脂的作用，且谷維素可以促進黃連素的體內(nèi)吸收[3]，在筆者的前期研究中發(fā)現(xiàn)兩者合用可產(chǎn)生協(xié)同降血脂的作用。目前關(guān)于谷維素的含量測定方法2010年版《中國藥典》尚未收錄，在衛(wèi)生部部頒藥品標準[4]中采用紫外分光光度（UV）法；而黃連素的含量測定在2010年版《中國藥典》中采用高效液相色譜（HPLC）法；文獻中采用HPLC法[5～8]和UV法[9～11]測定黃連素、谷維素含量的報道也較多，筆者對這些方法進行了逐一篩選，發(fā)現(xiàn)這些方法均無法排除同一種制劑中二者的相互干擾，實現(xiàn)同一制劑中2組分的同時測定，也未見如何同時分離測定黃連素與谷維素的文獻報道。新興的微乳液相色譜（Microemulsion liquid chromatography，MELC）是指以微乳為流動相的HPLC法，具有獨特的分離效能，分離效率高，國內(nèi)、外已有較多文獻報道[12～14]。筆者采用MELC法實現(xiàn)了黃連素與谷維素的同時分離測定，且準確度高、重復(fù)性好，可用于制劑的質(zhì)量控制分析，為后期黃連素與谷維素復(fù)方制劑的開發(fā)提供了研究基礎(chǔ)，彌補了同時分離測定黃連素與谷維素的研究空白。

1 儀器與試藥

Agilengt 1100 HPLC儀（美國安捷倫公司）；RD-200電子分析天平（德國賽多利斯公司）；超聲儀（江蘇昆山市超聲儀器公司）。

谷維素對照品（日本東京化成販殼株式會社，批號:YNPCO000172，純度:99%）；鹽酸小檗堿對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號:110713-200911，純度:86.8%，本試驗中黃連素含量以鹽酸小檗堿計算）；乙腈為色譜純，十二烷基硫酸鈉（SDS）、三乙胺（TEA）及其他試劑均為分析純；三合平脂膠囊（珠江醫(yī)院藥劑科提供，批號:091225、100124、100210，主要組分為谷維素與黃連素，制備時將黃連素與谷維素按一定比例（暫時不宜公開）物理混合后直接裝膠囊，不含其他輔料）。

2 方法與結(jié)果

2.1 測定波長的選擇

分別精密稱定谷維素和鹽酸小檗堿對照品適量，以乙腈作為溶劑制備成26.4 mg·L－1的谷維素對照品溶液和9.45 mg·L－1的鹽酸小檗堿對照品溶液，在200～500 nm波長范圍內(nèi)分別掃描，結(jié)果見圖1。

圖1 紫外光譜圖Fig 1 UV spectrum

比較谷維素和黃連素的紫外光譜圖可發(fā)現(xiàn)在230 nm波長處谷維素與黃連素吸收峰比較接近；另外在230 nm波長處可排除溶劑的干擾，基線穩(wěn)定性好，因此確定測定波長為230 nm。

2.2 微乳流動相的制備

取33 g SDS，加入約800 mL的0.5%TEA水溶液中，攪拌至完全溶解，再加入100 mL正丁醇、10 mL正辛烷和30 mL乙酸乙酯，最后加入0.5%TEA水溶液稀釋至1 000 mL，超聲15 min至形成澄明溶液，即得微乳流動相，磷酸調(diào)節(jié)pH＝3，0.45 μm濾膜過濾備用。

2.3 色譜條件

色譜柱采用Agilent XBD C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；采用“2.2”項下的微乳流動相，流速為1 mL·min－1；二極管陣列檢測器（DAD），檢測波長為230 nm；柱溫為30℃。

2.4 溶液制備

鹽酸小檗堿對照品溶液:精密稱定鹽酸小檗堿對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

谷維素對照品溶液:精密稱定谷維素對照品10 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

供試品溶液:精密稱定三合平脂膠囊內(nèi)容物粉末20 mg，置于100 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。

空白溶液:取乙腈稀釋后作為空白溶液。

2.5 專屬性考察

取鹽酸小檗堿對照品溶液、谷維素對照品溶液、空白溶液和供試品溶液各20 μL，進樣測定，記錄色譜圖。結(jié)果表明，鹽酸小檗堿的峰與相鄰的雜質(zhì)峰，以及谷維素主峰與相鄰的雜質(zhì)峰的分離度均符合要求，詳見圖2所示。

2.6 線性考察

取鹽酸小檗堿對照品10 mg、谷維素對照品10 mg置于50 mL量瓶中，加乙腈溶解并稀釋至刻度，搖勻備用。分別精密量取上述混合對照液1、2、5、10、15 mL置于25 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻。按“2.3”項下色譜條件，對5份對照品溶液各進樣20 μL，每個濃度重復(fù)進樣3次，測定并記錄峰面積。以濃度（c）與峰面積（A）進行線性回歸，得鹽酸小檗堿與谷維素線性方程分別為A＝6.742 8c－2.378 7（r＝0.999 8）、A＝22.615 2c+16.006 4（r＝0.999 1），結(jié)果表明二者檢測濃度線性范圍均為8～200 mg·L－1。

圖2 微乳液相色譜圖Fig 2 MELC chromatograms

2.7 加樣回收率試驗

分別精密量取2 mL已知濃度的樣品溶液3份于50 mL量瓶中，分別加入混合對照液2、5、10 mL，加流動相稀釋至刻度，搖勻，取20 μL進樣測定（n＝3），按“2.3”項下色譜條件測定，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 回收率試驗結(jié)果（n＝3）Tab 1 Results of recovery test（n＝3）

2.8 精密度試驗

精密量取混合對照液5 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，每次進樣20 μL，反復(fù)進樣9次，計算峰面積RSD值。結(jié)果黃連素RSD＝1.4%，谷維素RSD＝2.5%，表明本法精密度較好。

2.9 穩(wěn)定性試驗

精密量取混合對照液5 mL，置于50 mL量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，同日內(nèi)0、2、4、6、8 h進樣1次；連續(xù)3 d每天進樣1次，計算峰面積的RSD值。結(jié)果表明，黃連素在乙腈中穩(wěn)定性好，RSD＝1.6%；谷維素在乙腈中穩(wěn)定性較差，僅在8 h（1 d）內(nèi)保持穩(wěn)定，RSD＝3.4%。

2.10 方法耐用性考察

當(dāng)色譜柱由Agilent Eclipse XDB C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）更換為Agilent Hypersil ODS C18（250 mm×4.0 mm，5 μm）時，鹽酸小檗堿和谷維素的色譜峰變寬、保留時間延長，但鹽酸小檗堿峰與相鄰的雜質(zhì)峰，以及谷維素峰與相鄰的雜質(zhì)峰的分離度均大于1.5；柱溫在25～35℃變化以及流速在0.8～1.2 mL·min－1變化時，該方法仍然適用。

2.11 樣品含量測定

取批號為091225、100124、100210的樣品，分別按“2.4”項下供試品溶液制備方法制備，按照“2.3”項下色譜條件測定，每批樣品測定3次，取其平均值，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

谷維素在部頒標準UV法含量測定中所用溶劑為正庚烷，另有文獻報道[15～17]采用氯仿、乙醇、異丙醇等作為溶劑，而本試驗中筆者選用乙腈作為溶劑是因為黃連素不溶于正庚烷，而黃連素與谷維素在乙腈中均有較大的溶解度，并且以乙腈作為溶劑符合2010年版《中國藥典》附錄紫外-可見分光光度法中對溶劑的要求，因而選用乙腈作為溶劑。

2010年版《中國藥典》中黃連素含量測定采用HPLC法，其色譜條件為磷酸鹽緩沖液（0.05 mol·L－1磷酸二氫鉀和0.05 mol·L－1庚烷磺酸鈉溶液（1∶1），含0.2%三乙胺，并調(diào)pH至3.0）-乙腈（60∶40），但采用該方法同時測定黃連素與谷維素時，谷維素在120 min內(nèi)仍未出峰；部頒標準中，谷維素的含量測定方法為UV法，由于谷維素與黃連素在紫外吸收范圍內(nèi)均有吸收，無法實現(xiàn)制劑中2組分的含量測定。本試驗用微乳液相色譜法測定黃連素與谷維素復(fù)方制劑的含量，能夠有效地排除制劑中2組分的相互干擾，省時省力，準確性高，可用于制劑中黃連素與谷維素的含量測定和質(zhì)量控制。

谷維素是環(huán)木菠蘿醇類與阿魏酸組成的阿魏酸酯類混合物，本試驗將其作為一個整體的研究對象，進行含量測定的研究，能夠有效地實現(xiàn)制劑中谷維素含量的控制，與張連成等[5]報道的方法思路一致。

試驗中為消除黃連素與谷維素拖尾的現(xiàn)象，曾嘗試在流動相中添加0.2%～1%（V/V）的三乙胺，結(jié)果0.5%的三乙胺能使得峰形變窄、拖尾減輕，再加入3%乙酸乙酯后，峰形更為理想。

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