黃柏提取物在體外vero細胞中對單純皰疹病病毒2型的抑制作用

李 濤，彭立新，姜良英

（大慶油田總醫(yī)院 皮膚科，黑龍江 大慶 163001）

生殖器皰疹［1，2］是我國常見性傳播病之一，由單純皰疹病毒（HSV）感染所引起。目前國內(nèi)外研究的抗病毒藥物已接近50種［3］，以阿昔洛韋（ACV）為代表的核昔類藥物成為治療HSV感染的標(biāo)準藥物和一線用藥。

黃柏為蕓香科植物黃檗或黃皮樹的干燥樹皮，黃柏味苦、性寒，能清熱燥濕，瀉火解毒，消腫祛腐。臨床上用于治療濕熱瀉痢、黃疸、風(fēng)疹瘙癢及瘡瘍后傷口感染屬陽證者。近年研究發(fā)現(xiàn)黃柏具有免疫抑制、降壓、抗癌、抗氧化及抗病毒等新的藥理活性。本實驗研究旨在了解評價黃柏提取物在體外系統(tǒng)抗單純皰疹病毒2型的活性，為開發(fā)治療單純皰疹的新藥奠定基礎(chǔ)。

1 試驗材料

黃柏提取物（西安市天園生物制劑廠）；注射用阿昔洛韋（ACV浙江誠意藥業(yè)有限公司）；vero細胞（上海細胞生物研究所細胞庫）；HSV－2型質(zhì)控株（sav株）（北京中國藥品生物制品檢定所）。

2 試驗方法

2.1 濃度設(shè)置

黃柏提取物粉：在最大無毒濃度下，以溶媒稀釋藥物，受試終濃度為10、5、2.5、1.25、0.62、0.31 mg／ml 6個濃度。

對照藥ACV：以溶媒稀釋，受試終濃度為5，2.5，1.25，0.62，0.31，0.15μg／ml 6個濃度。

2.2 HSV接種

Vero細胞以2×105個／ml接種至96孔細胞培養(yǎng)板，每孔0.1 ml，37℃，5%CO2培養(yǎng)，細胞長成單層后進行實驗。HSV－2原液分別用細胞維持液依次10倍稀釋成10－1、10－2、10－3、10－4、10－5、10－6、10－7和10－88個稀釋度。

上述各稀釋度病毒液分別加入已成單層的Vero細胞培養(yǎng)板，每孔0.1 ml，每稀釋度4個復(fù)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)，實驗設(shè)正常細胞對照。24 h后倒置顯微鏡下觀察細胞病變，計算病變細胞占全部細胞的百分率及平均細胞病變百分率。

2.3 病毒毒力測定

0.5 ml病毒懸液分別接種至單層生長的vero細胞中，吸附1 h后去除，充維持液繼續(xù)培養(yǎng)，至95%以上細胞出現(xiàn)明顯病變。吸附病毒的細胞，經(jīng)反復(fù)凍融后收集病毒液作病毒毒力測定。

上述病毒液用培養(yǎng)液順序10倍稀釋后接種至96孔板的單層細胞中吸附，方法同上。在培養(yǎng)20 h和45 h后觀察細胞變化情況。每個稀釋度重復(fù)3孔。以20 h和45 h作為判斷時間點，毒性指標(biāo)判斷以及TCID50計算。

2.4 受試物對Vero細胞毒性測定

選擇生長良好的單層vero細胞，加上含不同濃度藥物的維持液（終濃度分別為20、5、2.5、1.25、0.62 mg／ml），37℃繼續(xù)培養(yǎng)，逐日觀察細胞生長情況，連續(xù)4天。以24、48、72、96 h作為判斷時間點，計算半數(shù)中毒濃度（TC50）。

2.5 藥物抗病毒試驗

分別將10－2和10－5病毒液按0.1 ml／孔，接種于生長在96孔培養(yǎng)板的單層細胞中。病毒吸附1小時。用含不同濃度受試物或?qū)φ账幍木S持液0.1 ml／孔處理細胞。每個受試濃度設(shè)3個復(fù)孔，同時設(shè)無藥對照。繼續(xù)培養(yǎng)至無藥對照孔的細胞病變率＞95%時中止培養(yǎng)。判斷時間點為20 h和45 h，計數(shù)各孔細胞病變率。以N（正常）／N＋P（病變）×100%計算藥物的抑制百分率。

3 監(jiān)測指標(biāo)

3.1 毒性指標(biāo) 細胞病變（CPE）直接鏡檢，計數(shù)病變細胞（P）／正常細胞＋病變細胞（N＋P）的比率，求出P的百分率。

3.2 TCID50計算 病毒半數(shù)感染劑量TCID50計算按Reed和Muencl常規(guī)法。

3.3 受試物對細胞毒性 計算TC50

3.4 受試物對病毒作用 觀察細胞病變（CPE）、計算抑制百分率、IC50。

4 計算方法與統(tǒng)計學(xué)方法

通過藥物的抑制百分率對藥物濃度求直線回歸方程，并計算IC50值。

統(tǒng)計學(xué)方法：作相關(guān)系數(shù)的顯著性檢驗。

5 試驗結(jié)果

病毒毒力測定結(jié)果見表1。HSV－2 Sav株病毒TCID50值20 h為2.37；45 h為4.12。藥物對vero細胞毒性測定結(jié)果見表2。24 h－96 h間細胞對黃柏提取物可耐受的TC50為9.72 mg／ml，TC0為4.36 mg／ml。黃柏提取物和ACV對HSV－2 Sav株致vero細胞病變的抑制作用見表3和表4。在最大無毒濃度下，病毒稀釋度分別為10－2和10－5，觀察時間分別為20和45 h，黃柏提取物對HSV－2 Sav株致vero細胞病變有抑制作用，IC50值分別為7.89 mg／ml和3.02 mg／ml。

表1 不同時間點HSV－2Sav株對vero細胞的毒力（TCID50）測定

表2 不同時間下黃柏提取物對vero細胞的毒性測定

單純皰疹病毒Ⅱ型［4］（HSV－2）主要是生殖器皰疹的主要病原體，存在于皮膚和粘膜損害的滲出液、精液、前列腺分泌液、宮頸、陰道分泌液中，主要通過性交傳染，引起生殖器感染［5，6］。

黃柏［7］在體外對金黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、肺炎雙球菌、大腸桿菌、綠膿桿菌、傷寒桿菌、腦膜炎雙球菌等，均有不同程度的抑制作用。蔡寶昌等［8］選擇32種天然藥物的熱水提取液，對接種了單純皰疹病毒而引發(fā)皰疹的小鼠給藥，與阿昔洛韋對照組及空白對照組比較，黃柏給藥組可延緩皰疹癥狀發(fā)作或擴散時間，延長小鼠生存時間，并顯著降低小鼠的死亡率。

通過我們研究表明：黃柏提取物具良好的抗HSV－2作用。目前臨床上治療HSV感染的系統(tǒng)藥物主要為無環(huán)鳥苷較為有效，且已被發(fā)現(xiàn)有耐藥株發(fā)生。以本次實驗研究為契機，進一步深入研究和探索黃柏提取物的有效成分和藥理機制，擴大臨床適應(yīng)癥，逐步建立適合于中醫(yī)藥特點的中藥藥效學(xué)評價模式、模型、方法和技術(shù)；開展適合中藥多成分和復(fù)雜作用特點的中藥篩選、發(fā)現(xiàn)和評價技術(shù)研究；在中醫(yī)藥理論指導(dǎo)下開展中藥有效成分及其作用機理研究，為開發(fā)治療單純皰疹的新藥奠定基礎(chǔ)。

表3 黃柏提取物對HSV－2 Sav株致vero細胞病變的抑制作用（病毒稀釋度：10－2，判斷時間：20小時）

表4 黃柏提取物對HSV－2 Sav株致vero細胞病變的抑制作用（病毒稀釋度：10－5，判斷時間：48小時）

［1］鄭秀峰.單純皰疹病毒研究現(xiàn)狀［J］.中國麻風(fēng)皮膚病雜志，2008，24（5）：370.

［2］Johnson RE，Nahmias AJ，Magder LS，et al.A seroepidemiologic survey of the prevalence of herpes simples virus type 2 infection in the United States.Nengl J Med，1989，321（1）：7.

［3］楊占秋.抗病毒藥物的臨床應(yīng)用現(xiàn)狀［J］.中國醫(yī)藥學(xué)雜志，1985（5）：13.

［4］Ashley RL.Genital herpes.Type－specific antibodies for diagnosis and management［J］.Dermatol Clin，1998，16：789.

［5］Johnson RE，Nahmias AJ，Magder LS，et al.A seroepidemiologic survey of the prevalence of herpes simples virus type 2 infection in the United States.Nengl J Med，1989，321（1）：7.

［6］Strans SE，Kost RG，Mckenzier，et al.Immunotherapy of recurrent genital herpes recombinant herpes simplex virus type－2 glycoprotein D and B：Results of a placebo－controlled vaccine trial［J］.J Infect Dis，1997，176（5）：1129.

［7］Chen ML，Xian YF，Ip SP，et al.Chemical and biological differentiation of Cortex Phellodendri Chinensis and Cortex Phellodendri Amurensis.Planta Med.2010 Oct；76（14）：1530－5.Epub 2010 Mar 30

［8］蔡寶昌，潘 揚，吳 皓，等.國外天然藥物抗病毒研究簡況［J］.國外醫(yī)學(xué)·中藥分冊，1997，19（3）：48.