毛細(xì)管電泳技術(shù)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的免疫學(xué)分型分析

李海煒，秦 雪＊，李 山，王 健，賴戰(zhàn)峰

（1.廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院 臨床醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)部，廣西 南寧530021；2.廣西醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)系）

電泳法分析血清或尿液中蛋白質(zhì)，輔助臨床診斷的重要性已被廣泛認(rèn)可。隨著電泳技術(shù)和儀器的發(fā)展，毛細(xì)管電泳技術(shù)（capillary electrophoresis，CE）逐漸受到重視。CE技術(shù)是一類以毛細(xì)管為分離通道、以高壓電場(chǎng)為驅(qū)動(dòng)力的分離分析技術(shù)，近年來該技術(shù)在科研和臨床領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用［1，2］。

多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）是一種骨髓漿細(xì)胞異常增生的惡性腫瘤，特點(diǎn)是骨髓中異常漿細(xì)胞（骨髓瘤細(xì)胞）大量增殖，合成和分泌大量結(jié)構(gòu)均一的單克隆免疫球蛋白（M蛋白）或（和）其輕鏈，引起骨痛及病理性骨折、貧血、出血、感染、腎功能損害、高鈣血癥和免疫球蛋白異常等臨床表現(xiàn)。該病臨床表現(xiàn)復(fù)雜多樣，易誤診或漏診，常規(guī)化療完全緩解率甚低，預(yù)后不良［3］。由于MM分泌異常免疫球蛋白的種類和數(shù)量不同，臨床常用血清蛋白電泳和免疫固定電泳技術(shù)（immunofixation electrophoresis，IFE）來檢測(cè) MM患者血清 M蛋白，并對(duì)MM進(jìn)行診斷和分型，而目前毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）運(yùn)用于MM免疫分型分析的報(bào)導(dǎo)國內(nèi)尚不多見。為了探討CE技術(shù)對(duì)MM診斷的應(yīng)用價(jià)值，本文對(duì)51例MM患者采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳法 （capillary zone electrophoresis，CZE）進(jìn)行血清蛋白電泳和采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法（immunosubtraction capillary zone electrophoresis，IS－CZE）進(jìn)行免疫分型，對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 標(biāo)本來源 來自廣西醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院2008年10月－2010年10月本院MM住院患者的血清標(biāo)本，共51例，其中男33例，女18例，年齡在38－82歲之間，診斷均符合國家診斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。靜脈取全血，分離后血清標(biāo)本置－20℃冰箱待用。

1.1.2 儀器與試劑 血清蛋白電泳和毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法（IS－CZE）電泳均采用法國sebia公司sebia capillaryⅡ型全自動(dòng)毛細(xì)管電泳儀檢測(cè)，版本為6.1.2，毛細(xì)管電泳試劑包括血清蛋白電泳試劑CAPILLARYS PROTEIN（Eβ1＋β2），批號(hào)為22090／01；IS－CZE試劑 CAPILLARYS IMMUNOTYPING，批號(hào)為15040／01。所用試劑均為原裝配套試劑。免疫球蛋白定量使用HITACHI日立7600全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)，試劑由上海執(zhí)誠提供。采用法國sebia公司HY－drasys電泳儀進(jìn)行免疫固定電泳分析，試劑為原裝配套試劑。

1.2 方法

1.2.1 毛細(xì)管血清蛋白電泳 使用sebia capillaryⅡ型全自動(dòng)電泳儀進(jìn)行分析，方法為毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）。將待檢血清和樣品稀釋小杯置于樣品架上，檢測(cè)程序選擇“血清蛋白6”全自動(dòng)進(jìn)樣和分析，產(chǎn)生6個(gè)峰，分別為白蛋白，α1球蛋白、α2球蛋白、β1球蛋白、β2球蛋白和γ球蛋白。健康人結(jié)果見圖1。

圖1 健康人毛細(xì)管血清蛋白電泳結(jié)果

1.2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法（IS－CZE） 使用sebia capillaryⅡ型全自動(dòng)電泳儀進(jìn)行分析。將待檢血清和抗體小杯（含ELP，抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清）置于樣品架上，檢測(cè)程序選擇“免疫分型”全自動(dòng)進(jìn)樣和分析，每個(gè)樣本共生成6個(gè)圖像，分別對(duì)應(yīng)的是依次加了ELP，抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清后電泳的結(jié)果。

1.2.3 免疫球蛋白定量 采用免疫比濁法進(jìn)行檢測(cè)。

1.2.4 免疫固定電泳（IFE） 對(duì)患者血清樣本進(jìn)行稀釋，各取10μl加入加樣梳內(nèi)，保濕5min后電泳。裝好加樣模板，依次加入抗血清ELP、抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清各10μl，電泳結(jié)束后進(jìn)行免疫固定程序約5min，染色后讀取結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 毛細(xì)管血清蛋白電泳結(jié)果 51例MM患者中，有50例血清蛋白電泳檢測(cè)出α、β區(qū)或γ區(qū)或β區(qū)和γ之間出現(xiàn)底部狹窄，高尖的M蛋白峰（峰高大于或等于2倍峰寬）。檢測(cè)結(jié)果見表1。

2.2 毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法結(jié)果 樣品分別與抗體小杯中的ELP，抗IgG、抗IgA、抗IgM，抗κ血清和抗λ血清混合，發(fā)生抗原抗體反應(yīng)，經(jīng)過生成抗原抗體復(fù)合物的樣品再分別進(jìn)入不同的毛細(xì)管進(jìn)行電泳，得到6個(gè)電泳圖譜，其中形成了復(fù)合物的蛋白在電泳圖譜中被消除。所以，如果在加入了某種抗體的電泳結(jié)果圖譜中，M蛋白峰消失，即為該種類型的M蛋白峰，判斷為該種類型的MM，得出其免疫分型，見圖2和圖3。M蛋白免疫分型結(jié)果為IgG31例，其中IgGκ型16例，IgGλ型15例；IgA型10例，其中IgAκ型5例，IgAλ型5例；IgMκ型2例；單純輕鏈型7例，其中κ型4例，λ型3例；雙克隆型1例。51例MM血清毛細(xì)管電泳免疫分型結(jié)果如表2。

圖2 患者IS－CZE電泳圖譜，分別是加了ELP，抗IgG、IgA、IgM，抗κ血清和抗λ血清后電泳的結(jié)果。在加入了抗IgG和抗λ血清的圖中M峰消失，檢測(cè)結(jié)果為IgG＋λ型

圖3 患者IS－CZE電泳圖譜，分別是加了ELP，抗IgG、IgA、IgM，K血清和抗λ血清后電泳的結(jié)果。在加入了抗IgA和抗κ血清的圖中M峰消失，檢測(cè)結(jié)果為IgA＋κ型

2.3 免疫球蛋白定量結(jié)果 51例MM患者中，有1例IgAκ型和1例IgMκ型患者表現(xiàn)為IgG含量升高，其余與毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法結(jié)果相符。

2.4 免疫固定電泳結(jié)果 免疫固定電泳結(jié)果與毛細(xì)管區(qū)帶電泳－免疫消減法結(jié)果相符。

2.5 51例MM患者入院初診斷分析 對(duì)51例MM患者病例資料的回顧性分析結(jié)果顯示，MM的臨床首發(fā)癥狀多樣化，可表現(xiàn)為腎臟損害、貧血、骨折、感染和心血管疾病等癥狀，由腎病綜合征、腎功能不全入院者15例（29.4%），由貧血、出血等入院者13例（25.5%），由肝病入院者10例（19.6%），其它原因較少，具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果詳見表3。

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤（MM）是一種漿細(xì)胞惡性增生性疾病，以中老年好發(fā)，近年來發(fā)病率呈上升趨勢(shì)［5，6］。臨床上的患者多因腎病、貧血、出血和骨病等表現(xiàn)就診，由于其臨床癥狀的不典型和多樣化，而且骨髓穿刺瘤細(xì)胞形態(tài)學(xué)檢查受穿刺部位、穿刺次數(shù)影響，不利于MM的早期診斷及治療。提高早期診斷率，對(duì)MM的治療具有重要意義。

表1 51例MM患者毛細(xì)管血清蛋白電泳結(jié)果及M帶出現(xiàn)區(qū)域

表2 51例MM患者血清IS－CZE電泳結(jié)果

表3 51例MM患者入院原因及入住科室分布

血清中出現(xiàn)M蛋白是MM診斷重要依據(jù)之一。M蛋白是單株漿細(xì)胞惡性增殖分泌的結(jié)構(gòu)均一的免疫球蛋白或其肽鏈亞單位，可分為lgG，IgA，IgM，lgD，IgE，游離輕鏈κ，λ7種類型，其檢出對(duì)MM的分型、病情、預(yù)后具有重要意義［7］。目前臨床上使用免疫比濁法進(jìn)行免疫球蛋白定量檢測(cè)以確定M蛋白的種類和數(shù)量，但是不能區(qū)分是否由巨球蛋白血癥、漿細(xì)胞性白血病等其它疾病造成的免疫球蛋白增高［8］；或使用以瓊脂糖凝膠作為遷移支持物的瓊脂糖凝膠電泳法（agar gel electrophoresis，AGE）進(jìn)行血清蛋白電泳和免疫固定電泳作為檢測(cè)M蛋白的重要手段，但是由于存在著技術(shù)的局限性和手工加樣的操作誤差，不同的實(shí)驗(yàn)室使用AGE法進(jìn)行電泳得出的檢測(cè)結(jié)果存在差異。故本研究使用毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）對(duì)51例 MM患者血清進(jìn)行分析，探討CE技術(shù)對(duì)MM診斷的臨床應(yīng)用價(jià)值。

使用毛細(xì)管電泳技術(shù)分別對(duì)MM患者進(jìn)行血清蛋白電泳和IS－CZE電泳的結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IS－CZE電泳可檢出全部血清中M蛋白峰，且與IFE結(jié)果相符；血清蛋白電泳存在一例漏檢。血清蛋白電泳具有一定的局限性，首先是不能區(qū)分M蛋白峰和其它蛋白峰，例如慢性肝炎病人在γ區(qū)或β－γ連接區(qū)間出現(xiàn)較鈍圓的峰，或者腎病綜合癥病人在α區(qū)和（或）β區(qū)出現(xiàn)的高尖的峰；其次為不能區(qū)分M蛋白峰的類型。利用IS－CZE進(jìn)行的免疫分型電泳則可鑒別M蛋白免疫類型。本實(shí)驗(yàn)分型結(jié)果顯示IgG型（60.8%）最多，IgA 型（19.6%）和輕鏈型（13.7）次之，IgM 型（3.9%）少見，雙克隆型（2.0%）最少見，與國內(nèi)劉玉梅［9］等的報(bào)道基本一致，但各類型百分比和輕鏈類型仍有差別，分析原因可能與地域差異和樣本量較小有關(guān)。因?yàn)镸M的治療方式與其免疫分型相關(guān)，故根據(jù)免疫球蛋白對(duì)MM進(jìn)行準(zhǔn)確的免疫分型對(duì)患者的治療具有重要意義。所以利用毛細(xì)管電泳技術(shù)進(jìn)行MM的免疫分型對(duì)其診斷和治療均具有較高臨床價(jià)值。另外，有研究表明，毛細(xì)管電泳技術(shù)（CE）是一種靈敏度、精確度更高的實(shí)驗(yàn)方法［1，10］，毛細(xì)管電泳技術(shù)在實(shí)現(xiàn)全自動(dòng)化的基礎(chǔ)上，儀器還可以識(shí)別患者樣品條形碼，與免疫固定電泳技術(shù)（IFE）相比具有分析時(shí)間更短，分辨率高，基線噪音低等優(yōu)點(diǎn)，簡(jiǎn)化了實(shí)驗(yàn)過程，使操作更加方便快捷［11，12］。

綜上所述，毛細(xì)管電泳技術(shù)中血清蛋白電泳可用于初步篩查是否存在M蛋白，IS－CZE電泳則可鑒別M蛋白免疫類型，對(duì)鑒定M蛋白血癥有較高的應(yīng)用價(jià)值。目前尚無早期診斷MM的方法，對(duì)臨床上不明原因的骨痛、貧血患者，和血清總蛋白、免疫球蛋白異常升高的患者應(yīng)進(jìn)行毛細(xì)管電泳，陽性結(jié)果可作為診斷MM的重要依據(jù)，從而實(shí)現(xiàn)早診斷早治療的目的。

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