唾液酸受體并非流感病毒各亞型在雪貂組織中播散分布的決定因子

占玲俊，鄧 巍，鮑琳琳，呂 琦，李楓棣，馬春梅，許黎黎，秦 川

(衛(wèi)生部人類疾病比較醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家中醫(yī)藥管理局人類疾病

動(dòng)物模型三級(jí)實(shí)驗(yàn)室 中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，北京 100021)

雪貂是研究流感病毒的理想動(dòng)物模型，但是不同亞型流感病毒感染雪貂后在組織中的分布情況如何，目前還沒有詳盡系統(tǒng)的數(shù)據(jù)。而病毒在宿主體內(nèi)的分布是流感病毒致病機(jī)制研究以及藥物和疫苗安全評(píng)價(jià)不可或缺的資料。

病毒在宿主體內(nèi)的播散和分布機(jī)制比較復(fù)雜，目前還未見系統(tǒng)的明確的報(bào)道。主要的影響因素包括：流感病毒的唾液酸受體的表達(dá)和分布；流感病毒蛋白HA上堿性酶切割位點(diǎn)的可切割性；宿主體內(nèi)能切割流感病毒使其能播散的酶，以及其它的相關(guān)酶［1-3］。

流感病毒的受體是唾液酸的糖鏈，糖鏈以糖脂和糖蛋白的形式存在于細(xì)胞表面。唾液酸在動(dòng)物細(xì)胞表面廣泛分布，不同物種其衍生物分子種類及其與半乳糖及連接鍵型不同。大多數(shù)禽流感病毒優(yōu)先識(shí)別結(jié)合于 SAα2，3Gal，人流感病毒優(yōu)先結(jié)合于SAα2，6Gal。其中SAα2，3Gal根據(jù)糖鏈β鏈的鏈接又分為 SAa2，3-Galβ(1-4)GlcNAc和 SAa2，3-Galβ(1-3)GlcNAc，分別與凝集素 MAAI和 MAAII結(jié)合，SAα2，6Gal則與SNA結(jié)合［1］。

本研究中將著重探討流感病毒H5N1，SH1N1，H3N2感染雪貂后在各組織中的分布，并用免疫熒光和共聚焦熒光顯微鏡分析組織上唾液酸受體的分布，并探討唾液酸受體分布與病毒在組織中分布的關(guān)系。

1 材料和方法

1.1 病毒

禽流感病毒 H5N1(A/VN/1203/04)、H5N1(SZ406H/06)、 H3N2(Brisbane/09)、 H3N2(Hongkong/09)和swine H1N1由本研究室保存。病毒在10日齡的雞胚上傳代后，測(cè)定病毒的滴度備用。

1.2 流感病毒感染雪貂

雪貂經(jīng)獸用氯胺酮輕度麻醉后，將流感A/HK/09 H3N2病毒株以 106TCID50，A/BR/09以 106TCID50，A/SZ/406H/06H5N1病毒株以102TCID50， A Vietnam/1203/2004以104TCID50每只雪貂鼻孔內(nèi)均勻滴入400μL病毒液。感染前0d采集鼻甲骨活檢，感染后1～5d鼻甲骨活檢檢測(cè)病毒載量和病毒滴度。感染后第5天處死雪貂，取雪貂的肝脾肺腸腦等組織做病毒滴度測(cè)定和免疫熒光。

1.3 樣品的采集和組織勻漿

感染后第5天，用氯胺酮麻醉雪貂，然后無(wú)菌操作取雪貂的組織臟器，包括心、肝、脾、肺、腎、腸、腦等，一部分樣品放在10%的中性福爾馬林中固定，一部分放到含1% 青-鏈霉素DMEM中，另一部分組織放入-80℃凍存?zhèn)溆谩?%甲醛溶液固定的組織用石蠟包埋，切成5μm的組織切片，用于后面的免疫熒光和病毒與受體結(jié)合的分析。DMEM中組織用電動(dòng)研磨器(Pro200，USA)研磨，2000r/min，10min離心后取上清液，用于病毒分離。

1.4 組織活病毒分離

將100μL組織勻漿10倍稀釋接種于MDCK細(xì)胞。每個(gè)滴度接種5個(gè)復(fù)孔。放37℃ CO2孵箱中吸附1h，補(bǔ)加DMEM培養(yǎng)基放入孵箱培養(yǎng)48h。從每孔中吸取50μL上清液至另一個(gè)96孔板中。每孔加入1%火雞血50μL，30m in觀察結(jié)果。結(jié)果按Reed-Muench法計(jì)算樣品的TCID50。

1.5 組織上唾液酸受體的檢測(cè)

石蠟包埋的組織切片脫蠟水合后，用PBS洗3遍，分別加入 FITC標(biāo)記的SNA和 MAA I(Vector laboratory)，濃度為10μg/m L，以及 TRITC標(biāo)記的MAAII(EY lab)，濃度為50μg/m L。作為對(duì)照，加入唾液酸酶A(pH 6.0)，37℃作用24h，唾液酸酶能切割非還原性的末端唾液酸殘基，優(yōu)先順序?yàn)椋篴 (2，6) ＞a(2，3) ＞a(2，8) ＞a(2，9)。PBS洗3遍后，加入熒光標(biāo)記的凝集素SNA、MAAI和 MAA II，與酶切過(guò)的組織4℃孵育過(guò)夜，而陰性對(duì)照組織片不加入熒光標(biāo)記的凝集素。在共聚焦熒光顯微鏡下觀察凝集素的結(jié)合。

1.6 活病毒與組織的結(jié)合

石蠟包埋的肺組織切片在二甲苯中脫蠟，然后在乙醇中水合。水合的組織切片放入盛有枸櫞酸鈉溶液中，微波爐中高火3min，停1min再中火7 m in進(jìn)行抗原修復(fù)。加入TPCK處理過(guò)的活病毒到組織切片上，37℃孵育24h，其中各加入100TCID50的H5N1和SH1N1與組織進(jìn)行孵育。孵育后，用羊血清封閉30min。分別加入1∶10000和1∶200的鼠源性抗流感病毒的單克隆抗體孵育，4℃過(guò)夜。加入1∶200稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗鼠的二抗，室溫避光孵育2h。用 TBS洗3次后，加入細(xì)胞核染色的熒光染料DAPI，共聚焦顯微鏡觀察活病毒結(jié)合的細(xì)胞定位。

2 結(jié)果

2.1 各亞型流感病毒在感染的雪貂各組織臟器中的分布

溫和的流感病毒 H1N1(CA7)和 H3N2(HK，BR)感染雪貂后，只能在腸道中分離到活病毒。而禽流感病毒 H5N1(SZ)感染雪貂后，在雪貂的肝、脾、肺、腸中均能分離到活病毒，但腦組織中未分離到活病毒；H5N1(Vietnam)感染雪貂后，肝、脾、肺、腸、腦組織中均能分離到活病毒。由此可見，高致病性禽流感能侵襲易感動(dòng)物的多組織臟器，其中H5N1(Vietnam)在雪貂中侵襲的組織比H5N1(SZ)廣泛，并且肝、脾、肺、腸組織中病毒的滴度高于H5N1(SZ)，說(shuō)明前者對(duì)雪貂的毒力大于后者(表1)。

表1 各亞型流感病毒感染的雪貂各組織的病毒分離結(jié)果(單位：log10 TCID50)Tab.1 Virus isolated from tissues of the influenza virus-infected ferrets.(Unit：log10 TCID50)

2.2 雪貂各組織中唾液酸受體的分布

利用直接熒光法利用FITC標(biāo)記的SNA檢測(cè)唾液酸受體 SAa2，6-Gal，而 FITC標(biāo)記的MAA I和TRITC標(biāo)記的MAA II分別檢測(cè)唾液酸受體SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc和 SAa2，3-Galb(1-3) GalNAc。

雪貂的主要組織臟器肺、肝、腎、腸、脾、心、腦組織分別做免疫熒光，通過(guò)熒光共聚焦觀察，發(fā)現(xiàn)上述組織上均有唾液酸受體的分布，其中SNA陽(yáng)性代表SAa2，6-Gal表達(dá)陽(yáng)性，MAAI和MAAII陽(yáng)性分別代表SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc和 SAa2，3-Galb (1-4)GlcNAc表達(dá)陽(yáng)性(表2)。

其中支氣管、肺、腎、回腸和盲腸的唾液酸受體分布的熒光共聚焦結(jié)果最典型，如圖1～3。其中圖1A是肺泡和細(xì)支氣管上唾液酸受體的分布情況，圖1B是支氣管上唾液酸受體的分布。可見支氣管，細(xì)支氣管和肺泡上 SAa2，6-Gal，SAa2，3-Galb(1-4) GlcNAc和SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc均有分布(圖1A，圖1B，見彩插2。表2)。腎臟上上述3種亞型的受體也均有分布 (圖2、圖3A見彩插3)。而回腸和結(jié)腸上僅有SAa2，6-Gal和Aa2，3-Galb(1-4) GlcNAc表達(dá)(圖3B、圖4見彩插4)。對(duì)照各組織的病理切片，可以明確免疫熒光的組織切片上的陽(yáng)性表達(dá)細(xì)胞類型(表2)。

表2 雪貂各組織臟器上唾液酸受體的分布Tab.2 Sialic acid receptor distribution in the tissues of ferret

2.3 流感活病毒與組織切片上唾液酸受體的結(jié)合

流感病毒H1N1可以與SAa2，6-Gal受體結(jié)合，而H5N1則可以和SAa2，3-Gal受體結(jié)合。通過(guò)組織切片的間接免疫熒光結(jié)果可以看出，H1N1主要是與支氣管上皮細(xì)胞上 SAa2，6-Gal受體結(jié)合，而H5N1則主要與支氣管肺泡細(xì)胞上 SAa2，3-Galb(1-4)GlcNAc結(jié)合。而這些陽(yáng)性細(xì)胞與同一組織上唾液酸分布的成鏡像吻合(圖3B、圖4見彩插4)。

3 討論

不同亞型流感病毒感染雪貂后，病毒在各組織中的分布不一樣，病毒滴度也存在差異。其中溫和型的流感病毒只在腸道中增殖，而禽流感病毒則可以在肝、脾、肺、腸、腦等多組織中繁殖。同一種亞型流感病毒感染雪貂后，不同組織病毒的分布不一樣，可能與唾液酸受體有關(guān)，也可能與宿主其它的限制因子有關(guān)，比如宿主酶。

上呼吸道作為流感感染的門戶，其唾液酸受體［SA(α-2，3)，SA(α-2，6)］的分布被重點(diǎn)關(guān)注。關(guān)于SA受體的分布的研究，Yasuo Suzuki等的研究發(fā)現(xiàn)唾液酸受體是流感病毒侵襲不同宿主的決定因子［1］，Nicholls的研究證明人呼吸道唾液酸受體分布是人源性和禽源性流感病毒廣泛播散的基礎(chǔ)［1，4］。

本研究發(fā)現(xiàn)，唾液酸受體在雪貂的主要組織臟器如心、肝、脾、肺、腎、腸、腦等組織均有分布，但是活病毒并沒有在相應(yīng)的各組織均有分布，尤其是人流感病毒和某些溫和的流感病毒。另外，體外活病毒與組織上唾液酸受體的結(jié)合，可以證實(shí)上述受體檢測(cè)結(jié)果的特異性和活性。由此可見，唾液酸受體并不是流感病毒在雪貂各組織分布的決定因子，而可能只是其中的條件之一?；蛘哌€有其它的受體和共受體。

高致病性的流感病毒(如H5N1)可以被普遍存在各組織的蛋白酶切割，其中最有可能的是一種重要的前體蛋白內(nèi)切酶弗林蛋白酶(furin)［5］。這種弗林蛋白酶使流感病毒具有組織泛向性，使流感病毒可以在動(dòng)物的許多組織中進(jìn)行復(fù)制，損害動(dòng)物重要的器官和組織，導(dǎo)致受感染的鳥類發(fā)生疾病和死亡。另外，還發(fā)現(xiàn)枯草桿菌蛋白酶也有切割多堿基位點(diǎn)的特性，并促進(jìn)病毒在宿主體內(nèi)廣泛繁殖和傳播［2，3，6］。

而LPAI、季節(jié)性流感病毒H3N2、H1N1和甲流H1N1在組織中分布于呼吸道和腸道，Bottcher及其同事發(fā)現(xiàn)人肺來(lái)源的絲氨酸跨膜蛋白2(TMPRSS2)和人呼吸道胰酶樣蛋白酶(HAT)能促進(jìn)人流感病毒的傳播［3，7，8］，而 Chaipan等［9］發(fā)現(xiàn)絲氨酸跨膜蛋白2和4(TMPRSS2，TMPRSS4)能激活1918年H1N1的HA，由此可見作為內(nèi)源性表達(dá)的酶TTSP(TMPRSS2，TMPRSS4)能活化HA并在外源性胰酶缺乏的情況下促進(jìn)流感病毒在組織臟器間傳播。

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