氯沙坦對機(jī)械通氣大鼠肺組織TNF-α和MPO表達(dá)的影響

牛志紅，張新日

(山西醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院呼吸科，太原 030001)

呼吸機(jī)所致肺損傷(ventilator-induced lung injury，VILI)是機(jī)械通氣最嚴(yán)重的并發(fā)癥，研究其發(fā)病機(jī)理和防治措施對提高機(jī)械通氣應(yīng)用水平有重要價(jià)值。近年來研究發(fā)現(xiàn)，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system，RAS)不但在急性肺損傷(ALI)時(shí)炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡中發(fā)揮了重要作用，而且在 VILI發(fā)病中也具有重要作用［1-4］。因此，適當(dāng)應(yīng)用血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)受體拮抗劑或血管緊張素轉(zhuǎn)化酶抑制劑對VILI應(yīng)具有一定防治作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察氯沙坦對機(jī)械通氣大鼠肺組織腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達(dá)量及髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的影響，探討氯沙坦對機(jī)械通氣肺損傷的抗炎保護(hù)作用。

1 材料和方法

1.1 動(dòng)物分組與模型制備

健康成年雄性 W ister大鼠24只(山西醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心提供，合格證號：SXCK(晉)2009—0001，清潔級)，體重300g～350g，隨機(jī)分為3組：①對照組：未行機(jī)械通氣；②呼吸機(jī)致肺損傷組(VILI組)：潮氣量40m L/kg；③氯沙坦干預(yù)組(LAP組)：機(jī)械通氣前30min腹腔注射氯沙坦30mg/kg。

大鼠經(jīng)25%的烏拉坦4m L/kg腹腔注射麻醉后行氣管切開。除對照組外，其余大鼠均通過橡膠管與小動(dòng)物呼吸機(jī)(DH-150型，浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠制造)相連接行機(jī)械通氣。通氣參數(shù)：潮氣量 40m L/kg，頻率 60次/min，吸/呼比 1∶3，PEEP為0，吸入氣體為室內(nèi)空氣，通氣時(shí)間為2h。

通氣結(jié)束后，腹主動(dòng)脈放血將大鼠處死，切取肺臟，肉眼觀察肺臟的大體改變，取右肺中葉用中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，行HE染色病理學(xué)檢查及TNF-α免疫組織化學(xué)染色檢測。取右肺中葉行肺濕/干重(W/D)比值測定。取左肺上葉-20℃保存，用于 AngⅡ含量測定。取左肺下葉-20℃保存，用于MPO活性測定。

1.2 肺組織TNF-α免疫組織化學(xué)染色

采用鏈霉親和素-生物素-過氧化酶復(fù)合物法(SABC)對肺泡上皮細(xì)胞和細(xì)支氣管上皮細(xì)胞進(jìn)行TNF-α免疫組織化學(xué)染色，具體操作步驟參照試劑盒(購自武漢博士德生物工程有限公司)說明進(jìn)行。兔抗大鼠抗體工作濃度為1∶100，以磷酸鹽緩沖液代替一抗作陰性對照。結(jié)果判斷：陽性染色為細(xì)胞漿內(nèi)出現(xiàn)棕黃色顆粒。在400倍光鏡下對每張組織切片隨機(jī)選取5個(gè)高倍視野進(jìn)行觀察。采用 BI-2000醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分別檢測每個(gè)視野 TNF-α染色陽性細(xì)胞的平均光密度值(A)，以上述5個(gè)視野的平均值作為該大鼠細(xì)支氣管上皮細(xì)胞 TNF-α蛋白表達(dá)的相對含量。

1.3 肺組織W/D比值測定

取右肺中葉用生理鹽水沖洗干凈表面血跡，再用無菌紗布吸干表面液體后稱重(濕重)，然后置于烤箱中 60℃過夜后再稱重(干重)，計(jì)算肺濕/干(wet/dry，W/D)比值。

1.4 肺組織勻漿AngⅡ含量檢測

將肺組織稱重后置于裂解液中，用組織勻漿機(jī)打碎后離心，取上清液用 ELISA法測定肺組織中AngⅡ含量。AngⅡ ELISA試劑盒由美國 GBD公司提供，操作過程嚴(yán)格按試劑說明書進(jìn)行。先在酶標(biāo)儀(Wellscan Mk3，芬蘭)上測出標(biāo)準(zhǔn)品吸光度并繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線，然后測定樣品吸光度并在標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣品濃度。

1.5 肺組織勻漿M PO活性測定

將肺組織稱重后制備組織勻漿，采用髓過氧化物酶檢測試劑盒(購自南京建成生物工程研究所)測定肺組織中MPO活性。測定方法及操作步驟按試劑盒說明進(jìn)行。

采用721分光光度計(jì)進(jìn)行比色，波長460nm，光徑1cm，蒸餾水調(diào)零，測定各管吸光度值。MPO活性用酶活力單位表示，即每克組織蛋白在37℃的反應(yīng)體系中使H2O2分解1μmol為1個(gè)酶活力單位。

文氏橋振蕩器,它是由同相放大器和RC串并聯(lián)反饋網(wǎng)路組成。具有振蕩較為穩(wěn)定、波形良好、振蕩頻率在較寬的范圍能方便地連續(xù)調(diào)節(jié)等優(yōu)點(diǎn)[6]。在文氏橋振蕩器拓?fù)渲性黾觿?dòng)態(tài)元件、非線性元件或者兩個(gè)文氏橋電路通過非線性耦合可構(gòu)成各類文氏橋混沌或超混沌振蕩電路[10-14]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

全部數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS 11.5軟件包進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，組間差異比較采用方差分析，各組均數(shù)間兩兩比較用 SNK-q檢驗(yàn)，相關(guān)性分析采用直線相關(guān)分析法，以P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 肺組織病理學(xué)改變

HE染色光鏡下觀察，對照組大鼠肺泡結(jié)構(gòu)和各級支氣管上皮完整，肺間質(zhì)無明顯炎癥細(xì)胞浸潤。VILI組大鼠可見彌漫性肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤，肺泡間隔增厚，部分肺泡破裂融合，小血管斷裂，肺泡腔內(nèi)有血性液體滲出。LAP組大鼠也可見到肺間質(zhì)水腫和炎癥細(xì)胞浸潤，但較VILI組明顯減輕(圖1～3見彩插5)。

2.2 肺濕/干比值測定結(jié)果

各組大鼠肺濕/干重比值(W/D)測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，VILI組大鼠肺W/D比值均明顯高于對照組和LAP組(均 P＜0.01)；VILI組與對照組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.3 肺組織AngⅡ含量檢測結(jié)果

2.4 肺組織TNF-α免疫組織化學(xué)染色測定結(jié)果

各組大鼠肺組織細(xì)支氣管上皮細(xì)胞TNF-α免疫組織化學(xué)染色測定結(jié)果見表1和圖4～6，(圖1～6見彩插5)。結(jié)果顯示，VILI組大鼠肺組織TNF-α表達(dá)水平明顯高于對照組和LAP組(均P＜0.01)；LAP組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.5 大鼠肺組織勻漿中M PO活性測定結(jié)果

各組大鼠肺組織勻漿中MPO活性測定結(jié)果見表1。結(jié)果顯示，VILI組大鼠肺組織勻漿中MPO活性明顯高于對照組和LAP組(均P＜0.01)；LAP組與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。

2.6 肺組織TNF-α蛋白表達(dá)與AngⅡ含量的相關(guān)性分析

相關(guān)分析結(jié)果表明，對照組與VILI組大鼠肺組織TNF-α蛋白表達(dá)與肺組織AngⅡ含量之間呈正相關(guān)(r=0.681，P＜0.05)。

表1 各組肺濕/干比重、AngⅡ含量、TNF-α表達(dá)水平及MPO活性的比較(±s)Tab.1 Comparison of W/D，AngⅡ content，TNF-α level and MPO activity in all groups(±s)

表1 各組肺濕/干比重、AngⅡ含量、TNF-α表達(dá)水平及MPO活性的比較(±s)Tab.1 Comparison of W/D，AngⅡ content，TNF-α level and MPO activity in all groups(±s)

注：與對照組比較：*P＜0.01；與 VILI組比較：#P＜0.01；與對照組比較，##P＜0.01。NOTE：*P＜0.01，compared with the control group；#P＜0.01，compared with the VILI group；##P＜0.01，compared with the control group.

檢測指標(biāo)(Indexes)對照組(Control group) VILI組(VILI group) LAP組(LAP group)例數(shù)n 888肺濕/干比重(W/D) 4.389±0.065 8.546±0.374* 4.711±0.194# AngⅡ含量(AngⅡcontent) 112.051± 7.777 451.159± 19.803* 457.660± 15.660## TNF-α水平(TNF-α level) 0.133±0.017 0.655±0.029* 0.166±0.023# MPO活性 U/L (MPO activity) 1.638±0.027 6.762±0.423* 1.677±0.026#

3 討論

近年來，腎素-血管緊張素系統(tǒng)(RAS)在急性肺損傷中的作用引起了人們的廣泛關(guān)注。大量研究表明，RAS主要成分-AngⅡ及其受體活性與急性肺損傷的發(fā)生密切相關(guān)［1-3］。AngⅡ作為一種致炎因子可調(diào)控多種炎癥細(xì)胞因子如TNF-α、IL-1、IL-6及IL-8等在肺組織中表達(dá)，是引起急性肺損傷的重要原因之一。Ruiz-Ortega等［5］研究發(fā)現(xiàn)，ALI時(shí)多種炎癥細(xì)胞在肺內(nèi)募集、活化，通過激活RAS產(chǎn)生大量AngⅡ。后者又可加劇肺部炎癥反應(yīng)，從而形成惡性循環(huán)，最終導(dǎo)致肺組織損傷［6］。

研究證實(shí)，RAS在 VILI發(fā)病中也具有重要作用［7］。機(jī)械通氣可直接或間接激活RAS系統(tǒng)，使其效應(yīng)物質(zhì)AngⅡ表達(dá)增多。AngⅡ通過激活炎癥細(xì)胞產(chǎn)生一系列炎癥細(xì)胞因子，這些炎癥細(xì)胞和細(xì)胞因子相互作用，構(gòu)成龐大而復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)體系，是引起肺生物傷的主要原因［5］。

在眾多的細(xì)胞因子中，TNF-α是炎癥反應(yīng)中最主要的促炎因子，可介導(dǎo)急性肺損傷時(shí)中性粒細(xì)胞在肺部聚集和活化，并啟動(dòng)炎癥反應(yīng)級聯(lián)放大效應(yīng)。研究表明［8］，在機(jī)械通氣肺損傷早期即可出現(xiàn)TNF-α高表達(dá)，提示TNF-α可能是引起炎癥反應(yīng)的始動(dòng)因素。然而，TNF-α表達(dá)是通過何種途徑來調(diào)控的目前尚不完全清楚。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VILI組大鼠肺組織AngⅡ含量及TNF-α水平表達(dá)明顯高于對照組，而且TNF-α蛋白表達(dá)與AngⅡ含量呈正相關(guān)。說明AngⅡ作為肺部炎癥反應(yīng)復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)中的一個(gè)關(guān)鍵物質(zhì)，對調(diào)控TNF-α表達(dá)有重要作用。

目前認(rèn)為，AngⅡ介導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)的主要受體是AT1受體［7］。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究表明，在各種原因所致的急性肺損傷中，肺組織中 AngⅡ及其受體AT1的表達(dá)水平均顯著增高［3.9，10，］。因此我們推測，AngⅡ所介導(dǎo)的VILI發(fā)病過程有可能是通過AT1受體來實(shí)現(xiàn)的，因此，阻斷 AngⅡ與 AT1結(jié)合對防治VILI發(fā)生至關(guān)重要。

氯沙坦是一種二苯四咪唑類 AT1型受體拮抗劑，具有選擇性好，特異性高等特點(diǎn)，可特異性阻斷AngⅡ與AT1結(jié)合而發(fā)揮拮抗作用。研究表明，氯沙坦不僅具有抗炎作用，而且還有抗氧化和防止細(xì)胞凋亡等作用［10，11］。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，氯沙坦干預(yù)組大鼠肺組織AngⅡ含量與VILI組比較無明顯差異，但肺組織TNF-α蛋白表達(dá)水平、肺組織勻漿中MPO活性和肺W/D比值均較VILI組明顯降低，同時(shí)，肺組織病理損傷程度也較VILI組明顯減輕。說明氯沙坦可通過阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合而抑制TNF-α的表達(dá)，減輕肺組織炎癥性損傷，對 VILI具有一定保護(hù)作用。

綜上所述，AngⅡ通過調(diào)控肺組織中TNF-α的表達(dá)在VILI發(fā)病中起著重要作用，氯沙坦可阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合，抑制 TNF-α的表達(dá)，對VILI具有一定防治作用，但AngⅡ通過何種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑來調(diào)控TNF-α表達(dá)尚有待深入研究。

［1］Marshall RP，Gohlke P，Chambers RC，et al.Angiotensin II and the fibroproliferative response to acute lung injury［J］.Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol，2004，286(1)：156-164.

［2］Raiden S，Pereyra Y，Nah mod V，et al.Losartan，a selective inhibitor of subtype AT1receptors for angiotensin II，inhibits neutrophil recruitment in the lung triggered by fMLP［J］.J Leukoc Biol，2000，68(5)：700-706.

［3］Lukarinen H，Laine J，Lehtonen J，et al.Angiotensin II receptor blockade inhibits pneumocyte apoptosis in experimental meconium aspiration［J］.Pediatr Res，2004，55(2)：326-333.

［4］Yao SL，F(xiàn)eng D.Losartan attenuates ventilator-induced lung injury［J］.J surg Res，2008，145(1)：25-32.

［5］Ruiz-Ortega M，Lorenzo O，Suzuki Y，et al.Proinflammatory actions of angiotensin［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens.2001，10(3)：321-329.

［6］劉玲，邱海波，楊毅，等.血管緊張素II-血管緊張素II 1型受體途徑在介導(dǎo)肺部炎癥反應(yīng)中的作用［J］.中華急診醫(yī)學(xué)雜志，2007，16(6)：601-605.

［7］W?sten-van Asperen RM，Lutter R，haitsma JJ，et al.ACE mediates ventilator-induced lung injury in rats via angiotensin II but not bradykinin［J］.Eur Resp J.2008，31(2)：363-371.

［8］謝麗娟，朱曉東，沈藝，等.TNF-α和IL-8在幼兔機(jī)械通氣肺損傷炎癥反應(yīng)中的作用［J］.上海第二醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2005，25(4)：392-395.

［9］Imai Y，Kuba K，Rao S，et al.Angiotensin-converting enzyme 2protects from severe acute lung failure［J］.Nature，2005，436(7047)：112-116.

［10］Raiden S，Nah mod K，Namod V，et al.Nonpeptide antagonists of AT1receptor for Angiotensin II delay the onset of acute respiratory distress syndrome［J］.J Pharmacol Exp Ther.2002，30(1)：45-51.

［11］沈利漢，莫紅纓，蔡立華.氯沙坦對血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的影響［J］.國際呼吸雜志，2010，30(16)：973-975.