人工哺育期腹瀉嬰猴奇異變形桿菌的分離與鑒定

趙 遠(yuǎn)，楊鳳梅，陳麗雄，禹文海，王俊斌，和占龍

（中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院/北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所，云南省重大傳染病疫苗研發(fā)重點實驗室，昆明 650118）

奇異變形桿菌（Proteusmirabilis，P.mirabilis）在自然界中分布很廣，為條件致病菌。由奇異變形桿菌引起人類的腹瀉，尤其嬰幼兒腹瀉，或由奇異變形桿菌合并引起新生兒腹瀉的報道屢見不鮮［1，2］，但它造成恒河猴嬰猴腹瀉，尚無報道。盡管實驗動物國家標(biāo)準(zhǔn)（GBl4922—2001）并未將奇異變形桿菌列為實驗獼猴必檢項目。但仍需指出的是：該菌為條件致病菌，一旦攜帶者受不良條件影響或外來因素刺激，可能引發(fā)傳染病，造成嚴(yán)重后果［3］。2011年4月，本場離乳嬰猴230只在進(jìn)行隔離飼養(yǎng)至1周歲期間，1周內(nèi)先后有21只出現(xiàn)重度腹瀉，4只在4 d后死亡。本試驗從嬰猴糞便及腸道內(nèi)分離到1株細(xì)菌，經(jīng)對分離到的細(xì)菌進(jìn)行形態(tài)特征、培養(yǎng)特性、生化特性進(jìn)行鑒定，鑒定為奇異變形桿菌。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基及試劑：HE、S.S，GN增菌液、普通營養(yǎng)肉湯、三糖鐵瓊脂和生化試驗用培養(yǎng)基、腸桿菌科細(xì)菌生化編碼鑒定管及補充生化管（均購自杭州天和微生物試劑有限公司），革蘭氏染液（青島日水生物技術(shù)有限公司），藥敏紙片（北京天壇生物技術(shù)開發(fā)有限公司）。

1.1.2 診斷血清：沙門氏菌、志賀氏菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌及腸出血性大腸埃希菌診斷血清（均購自蘭州生物制品研究所），所有試劑均在有效期內(nèi)使用。

1.1.3 儀器設(shè)備：Olympus顯微鏡（日本），恒溫培養(yǎng)箱（上海）。

1.1.4 動物：昆明小鼠，由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)生物學(xué)研究所提供，生產(chǎn)許可證號：SCXK（滇）2010-0003，使用許可證號：SYXK（滇）2010-0007。

1.1.5 樣品：采集發(fā)病初期嬰猴糞便及死亡嬰猴腸道內(nèi)容物。

1.2 方法

1.2.1 臨床癥狀：本場在對離乳嬰猴230只進(jìn)行隔離飼養(yǎng)至1周歲期間，1周內(nèi)先后有21只出現(xiàn)腹瀉，4只在4 d后死亡。所有患猴呈急性爆發(fā)性腹瀉，拒食，腹部膨脹，陣發(fā)顫抖或精神萎靡。糞便開始為水樣或土紅色粘液便，后期帶血絲，嚴(yán)重者為粘液膿血便?；己矬w溫初始升高，隨后兩天下降。部分患猴出現(xiàn)彎腰、抱腹、壓迫痛等腹痛癥狀。病程3～5 d。

1.2.2 病理剖檢變化：腹腔積液，回腸、盲腸和結(jié)腸粘膜層出現(xiàn)條狀出血斑，漿膜層有密布的網(wǎng)狀出血點。腸管充氣膨脹，腸壁變薄，呈透明狀，腔內(nèi)充滿黑紅色膠凍狀物。

1.2.3 細(xì)菌培養(yǎng)分離：將糞便及腸內(nèi)容物接種到GN增菌液孵育6 h，分別接種于HE瓊脂和S.S瓊脂，37℃培養(yǎng)24 h，觀察結(jié)果，挑取單個典型菌落轉(zhuǎn)種瓊脂斜面，37℃培養(yǎng)24 h。

1.2.4 生化試驗：將分離菌株的純培養(yǎng)物分別接種于腸桿菌科GYE-11編碼鑒定管進(jìn)行生化鑒定，補充做TSI、氧化酶、V-P、MR、半固體、棉子糖、山梨醇、側(cè)金盞化醇、木膠糖、七葉苷、水楊素、明膠、麥芽糖生化試驗。

1.2.5 染色鏡檢：上述病料直接涂片革蘭氏染色后鏡檢，挑取純培養(yǎng)物涂片、革蘭氏染色后鏡檢。

1.2.6 藥敏試驗：對分離菌用紙片擴散法進(jìn)行常用抗菌類藥物的敏感性試驗，37℃培養(yǎng)24 h，后取出，觀察結(jié)果并測量抑菌圈大?。╩m）。判定標(biāo)準(zhǔn)按美國CLSI的抗微生物藥物敏感性試驗操作方法和判斷標(biāo)準(zhǔn)［4］。

1.2.7 致病性試驗：選用分離鑒定好的奇異變形桿菌，肉湯培養(yǎng)18 h后，各取0.5 mL培養(yǎng)液（菌液濃度均調(diào)整到8×109cfu/m L），腹腔注射于4只17 g～20 g昆明小鼠，對照組4只做0.5 m L無菌肉湯注射。

1.2.8 血清凝集試驗：采用玻片法。取滅菌玻片，用接種環(huán)挑取分離菌株的純培養(yǎng)物，分別與上述6種診斷血清及生理鹽水混勻，上下?lián)u動玻片數(shù)次，1 mm～3 min后觀察結(jié)果。判斷標(biāo)準(zhǔn)：陽性—待檢菌明顯凝集，陰性—待檢菌均勻渾濁。

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌形態(tài)

病料直接涂片、染色鏡檢可見大量革蘭氏陰性、兩端鈍圓，單個或短鏈狀的小桿菌，無芽胞和莢膜；挑取純培養(yǎng)物，生理鹽水適當(dāng)稀釋直接涂片、染色鏡檢可見與上述形態(tài)相同的革蘭氏陰性小桿菌。

2.2 培養(yǎng)特性

分離菌株在SS瓊脂平板形成無色透明菌落，部分菌落中央呈黑色（產(chǎn)H2S），在HE瓊脂平板呈淡藍(lán)色透明菌落，扁平、濕潤、邊緣薄，中央呈黑色（產(chǎn)生H2S）。

2.3 生化特性

對可疑菌株純培養(yǎng)物氧化酶陰性，TSI陽性（三糖鐵斜面上呈下部黑色、中部和上部淡紅色）。依照腸桿菌科細(xì)菌生化鑒定編碼冊，做以下11項生化反應(yīng)，鑒定值為AG302，鑒定結(jié)果為奇異變形桿菌，補做13項生化反應(yīng)，結(jié)果見表1。

2.4 藥敏試驗

分離菌株進(jìn)行抗生素敏感性實驗，結(jié)果顯示該菌株對頭孢類（頭孢曲松鈉、頭孢哌酮鈉、頭孢呋辛鈉、頭孢噻肟）高度敏感，對阿米卡星、氯霉素和氧氟沙星為中度敏感，而對氨芐西林、諾氟沙星、磺胺異惡唑、慶大霉素、磺胺甲基異惡唑/甲氧芐啶均不敏感，詳見表2。

2.5 血清凝集試驗

分離菌與沙門氏菌、志賀氏菌、腸致病性大腸埃希菌、腸產(chǎn)毒性大腸埃希菌、腸侵襲性大腸埃希菌及腸出血性大腸埃希菌屬因子血清均不凝集。

2.6 致病性試驗

致病性試驗結(jié)果顯示，攻毒組小鼠均在14 h內(nèi)死亡，剖檢死亡小鼠發(fā)現(xiàn)，肝、脾淤血發(fā)黑，肺、心臟有出血點或出血斑。腸管充血膨脹，腸壁變薄呈透明狀。十二指腸嚴(yán)重充血水腫，并能從內(nèi)臟中分離到接種菌；對照組均健活。

3 討論

從上述細(xì)菌形態(tài)、培養(yǎng)特性和生化特性可以證實，分離菌為奇異變形桿菌。變形桿菌屬為腐敗細(xì)菌，在自然界分布甚廣，在人和動物的腸道中也經(jīng)常存在。該屬細(xì)菌主要有普通變形桿菌、摩根變形桿菌、奇異變形桿菌。容易在受污染并經(jīng)過放置高蛋白食物中大量繁殖。攝取這種食物容易引起變形桿菌食物中毒［5，6］。

在以往有關(guān)變形桿菌引起獼猴腹瀉的報道中，主要是摩根氏（P.morganii）和普通變形桿菌（P.vulgaris）［7］。通過實驗感染和以普通變形桿菌噬菌體治療患猴的方法，人們早已證實了普通變形桿菌的致病性。必須指出的是，變形桿菌是獼猴的正常菌群之一，從正常獼猴糞便中均能分離出來，能引起體弱者突發(fā)腹瀉［7］。至于奇異變形桿菌，近年來，不斷有猴、禽類、小鼠、水貂等多種動物感染奇異變形桿菌病的報道［8-12］，但是，奇異變形桿菌感染引起人工哺育期嬰猴群體性發(fā)病的報道在國內(nèi)鮮有報道。

表1 分離菌株生化鑒定結(jié)果Tab.1 Biochem ical characterization of theisolated Proteusmirabilis

表2 分離菌株藥敏試驗結(jié)果Tab.2 Results of antibiotic sensitivity test of the isolated Proteusmirabilis

分析此次腹瀉流行的原因，主要是嬰猴斷奶后進(jìn)行人工哺育，在人工飼養(yǎng)初期由于來自母乳的營養(yǎng)及抗體可以幫助嬰猴抵御疾病以及抗過敏。盡管人工哺育嬰猴期間的飼料、牛奶等食物均通過高溫蒸煮，且是現(xiàn)配現(xiàn)喂，可以排除食物中毒的可能。然而在人工哺育一段時間后面臨著環(huán)境和飼料的改變等問題，這些因素可引起嬰猴肺炎、抵抗力下降、菌群失調(diào)，從而導(dǎo)致奇異變形桿菌誘發(fā)腹瀉，造成群體腹瀉爆發(fā)流行。同時，在這一時期，嬰猴腹瀉、肺炎發(fā)病率較高，廣譜抗菌素的大量使用，也使得此次分離到的奇異變形桿菌對氨芐西林、諾氟沙星、慶大霉素、磺胺異惡唑、氧氟沙星等常用抗生素耐藥，而對頭孢類比較敏感。藥敏試驗的結(jié)果指導(dǎo)臨床治療也取得了很好效果，對發(fā)病嬰猴進(jìn)行及時隔離，并配合藥敏結(jié)果給藥，合理調(diào)整飲食，在一個月內(nèi)，所有發(fā)病動物全部康復(fù)，疾病徹底得到控制。

雖然奇異變形桿菌不是實驗獼猴所必須排除的病原菌，且一般認(rèn)為該菌為條件致病菌［13，14］，但從本試驗分離到的菌株來看，該菌不但引起嬰猴群體性腹瀉并造成4只嬰猴短期內(nèi)死亡，而且致病性試驗結(jié)果也顯示其對小鼠有較強的致病性。同時，該菌還能在人猴間進(jìn)行傳播［8］，對研究人員和實驗動物均有潛在的危害，對動物實驗也可能造成不利影響。奇異變形桿菌可引起人類原發(fā)性或繼發(fā)性感染，也能造成人類食物中毒，其作為人畜共患傳染病病原，應(yīng)引起重視。

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［2］陳宏.28例新生兒奇異變形桿菌性腸炎治療體會［J］.鐵道醫(yī)學(xué)，1995，23（6）：374.

［3］中華人民共和國國家標(biāo)［S］.GBl4922.2—2001實驗動物微生物學(xué)等級及監(jiān)測.

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