HPLC測定鼠曲草中槲皮素的含量

韋少宣，夏愛軍，廖厚知(.廣西中醫(yī)藥大學藥學院中藥教研室，廣西南寧500;.解放軍第0醫(yī)院藥劑科，廣西南寧500;.廣西匯科藥物研究所，廣西南寧50007)

鼠曲草(Gnaphalium affine D.Don.)為菊科植物，又名清明菜、田艾、佛耳草、土茵陳、酒曲絨等，以全株入藥，具有止咳平喘，降血壓，祛風濕之功。主治感冒咳嗽，支氣管炎，哮喘，高血壓，蠶豆病，風濕腰腿痛;外用治療跌打損傷，毒蛇咬傷［1］?；瘜W成分主要為生物堿、揮發(fā)油、甾醇類和黃酮類等化合物［2］。槲皮素為鼠曲草的有效成分之一，本研究建立了槲皮素的含量測定方法，旨在為鼠曲草的質(zhì)量標準制定提供實驗依據(jù)。

1 儀器和材料

1.1 儀器 LC-2010A高效液相色譜儀(日本島津制作所);SPD-M10Avp紫外檢測器(日本島津制作所);十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱(VP-ODS柱，150 mm×4.6 mm)，保護柱:YWG C18(10 mm×4.6 mm);AB265-S分析天平(梅特勒-托利多);UV-2450分光光度計(日本島津制作所)。

1.2 材料 槲皮素對照品(中國藥品生物制品檢定所);乙腈為色譜純，鹽酸、磷酸均為分析純。鼠曲草，藥材(由廣西匯科藥物研究所工程師廖厚知工程師采集并鑒定為鼠曲草)采集地點分別為廣西南寧(G1)、防城(G2)、百色(G3)、柳州(G4)、河池(G5)、玉林(G6)、梧州(G7)。

2 方法和結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱為島津VP-ODS柱(150 mm×4.6 mm);流動相為甲醇-0.2%磷酸溶液(45∶55);流速為1.0 ml/min，柱溫為室溫;檢測波長為375 nm，理論板數(shù)按槲皮素計不低于4 000，此條件下槲皮素與其他成分分離度不低于1.5。

2.2 溶液的配置

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取槲皮素對照品適量，加甲醇適量制成每1 ml含30 μg的溶液，即得。

2.2.2 樣品溶液的制備 取本品粉末(過三號篩) 1 g，精密稱定，置索氏提取器中，加石油醚(60～90℃)80 ml，加熱回流提取至無色，棄去石油醚液，殘渣揮去石油醚，置100 ml圓底燒瓶中，加甲醇-2.5 mol/L鹽酸溶液(4∶1)40 ml，水浴加熱回流60 min放冷，濾過，濾液移至50 ml量瓶中，殘渣用少量甲醇洗滌，洗液并入量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，0.45 μm微孔濾膜濾過，即得。

2.3 系統(tǒng)性試驗 分別精密吸取對照品溶液、樣品溶液各20 μl，注入高效液相色譜儀，按確定的色譜條件測定，在此條件下樣品中槲皮素的理論塔板數(shù)為4 518，分離度為4.8，與其他成分分離良好，見圖1。

圖1 槲皮素對照品(A)、供試品溶液(B)高效液相色譜圖

2.4 線性關(guān)系的考察 精密稱取槲皮素對照品10.22 mg，置100 ml量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密吸取1、2、3、4、5 ml，分別置10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得。按上述色譜條件，分別進樣20 μl，測定，以峰面積積分Y對槲皮素進樣量X(μg)進行回歸分析，得回歸方程:Y= 2 020 660X－35 365，r=0.999 7。表明槲皮素在10.22～51.10 μg/ml濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 儀器精密度實驗 取槲皮素對照品溶液(30.66 μg/ml)，按上述色譜條件，依法操作測定，重復(fù)進樣5次，測定色譜峰面積，計算RSD值為0.12%，表明儀器精密度良好。

2.6 樣品溶液穩(wěn)定性實驗考察 精密吸取同一批樣品(G1)溶液20 μl，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液，在2、4、6、8、24、48、72 h時間間隔進行分析，測定色譜峰面積，計算RSD值為0.95%，表明樣品溶液制備后72 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性實驗 取同一批號樣品6份(G1)，按樣品溶液制備方法制備樣品溶液，測定含量進行分析，結(jié)果平均含量為1.123 mg/g，RSD為1.05%，表明本測定方法重復(fù)性好。

2.8 加樣回收率實驗考察 取已知準確含量(1.123 mg/g)的樣品6份(G1)，每份取0.5 g，精密稱定，置100 ml圓底燒瓶中，精密加入1 ml槲皮素對照品溶液(0.552 mg/ml)，揮去甲醇，按樣品溶液制備方法制備，分別注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件下測定槲皮素峰面積，計算回收率，結(jié)果見表1。表明本方法回收率良好。

表1 回收率實驗考察結(jié)果

2.9 樣品的含量測定 取鼠曲草7批，按上述方法測定，表明不同產(chǎn)地的鼠曲草中槲皮素的含量在0.088%～0.123%之間，平均含量為0.109%，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定實驗考察結(jié)果

3 討論

鼠曲草作為廣西民間草醫(yī)常用藥材，在民間具有廣泛的應(yīng)用，壯族的特色食品糍粑中就含有鼠曲草。但其相關(guān)文獻報道較少，目前還沒有相關(guān)的質(zhì)量控制的報道。為此，本研究以鼠曲草中槲皮素的含量作為測定指標，建立方法，旨在為鼠曲草藥材的質(zhì)量控制提供含量測定依據(jù)。本研究中，在鼠曲草藥材的提取上探討過70%甲醇超聲提?。?］，70%乙醇回流提?。?］，結(jié)果雜質(zhì)峰都太多，難以分離。采用石油醚提取后，藥渣分別用甲醇-鹽酸回流提取30、60、90 min，結(jié)果槲皮素峰均能與雜質(zhì)峰較好分離;提取30 min未能提取完全;提取60 min與90 min基本無差異。為節(jié)省試驗時間，故選擇60 min。在流動相的選擇上探討過甲醇-水(35∶65)［3］，結(jié)果槲皮素出峰時間較久;甲醇-0.4%磷酸水溶液(50∶50)［4］，結(jié)果分離度未達到要求;流動相換成甲醇-0.2%磷酸水溶液(45∶55)后，色譜圖各種參數(shù)達到要求。

［1］ 《全國中草藥匯編》編寫組.全國中草藥匯編:上冊［M］.北京:人民衛(wèi)生出版社，1996:894.

［2］ 國家中醫(yī)藥管理局，《中華本草》編委會.中華本草:第7冊［M］.上海:上?？茖W技術(shù)出版社，1999:848.

［3］ 李少鋒，崔桂友.高效液相色譜法測定丁香中槲皮素的含量［J］.揚州大學烹飪學報，2011，28(1):51.

［4］ 王 麗，呂圭源，王 利.HPLC測定烏藥葉中槲皮素的含量［J］.北京聯(lián)合大學學報:自然科學，2011，25(2):50.