HIV－P24核酸適配體的篩選

張 寧，毛愛紅，馬 瑾，廖世奇*，張麗瓊，王曉清，馬 君

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州730050)

HIV－P24核酸適配體的篩選

張 寧1，毛愛紅2，馬 瑾2，廖世奇2*，張麗瓊1，王曉清2，馬 君1

(1.蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅蘭州730050;2.甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院，甘肅蘭州730050)

目的 利用SELEX技術(shù)篩選HIV-P24的核酸適配體，為艾滋病的診斷和治療奠定基礎(chǔ)。方法 以重組P24為篩選靶，用SELEX技術(shù)從隨機(jī)寡核苷酸庫中篩選與HIV-P24結(jié)合的寡核苷酸，利用凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定第12輪篩選到的寡核苷酸與HIV-P24的結(jié)合，再用Dot-blot法篩選出與HIV-P24結(jié)合的核酸適配體，并檢測(cè)核酸適配體識(shí)別HIV-P24的特異性。結(jié)果 Dot-blot篩選到5條與HIV-P24有較強(qiáng)結(jié)合能力的核酸適配體，且均為不同的序列。特異性檢測(cè)顯示，18和26號(hào)配體只與HIV-P24特異性結(jié)合，而與人血清白蛋白、牛血清白蛋白和脫脂奶粉均無明顯結(jié)合。結(jié)論 成功篩選到2條特異結(jié)合HIV-P24的核酸適配體，為其應(yīng)用于艾滋病診斷和治療提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

SELEX技術(shù);HIV-P24;核酸適配體

P24是HIV-1的核心抗原，在病毒的包裝和成熟過程起重要作用。機(jī)體感染HIV-1后，P24在血清中出現(xiàn)的時(shí)間較早，一般在HIV-1感染后2～3周就可以檢測(cè)，可作為艾滋病窗口期檢測(cè)的血清標(biāo)志物。通過檢測(cè)血液中的P24，可達(dá)到早期診斷和治療的目的［1－2］。

核酸適配體是通過SELEX技術(shù)篩選得到的一類寡核苷酸分子，能與靶分子強(qiáng)特異、高親和力地結(jié)合，并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)［3－4］。由于其篩選靶分子范圍廣、分子質(zhì)量小、免疫原性低，且可進(jìn)行化學(xué)合成、改造與標(biāo)記［5］，核酸適配體越來越受到人們的青睞。目前，在化學(xué)分析與檢測(cè)、臨床診斷與治療及藥學(xué)等領(lǐng)域已對(duì)其開展廣泛的應(yīng)用基礎(chǔ)研究［6－9］。

本研究利用SELEX技術(shù)篩選HIV-P24特異性核酸適配體，為建立核酸適配體輔助的P24檢測(cè)方法奠定基礎(chǔ)，對(duì)艾滋病的診斷和治療具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料

HIV-P24重組蛋白(2 g/L)(北京科衛(wèi)臨床診斷試劑有限公司);隨機(jī)寡核苷酸庫(2.5 nmoles，84 bp)5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC40(N)CT GCAGGTCGACGCATGCGCCG-3'(N=A，T，C，G)、引物 P9(5'-TAGGGAATTCGTCGACGGATCC-3')、P12(5'-CGGCGCATGCGTCGACCTGCAG-3')和M13-47(5'-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3')(上海生物工程公司合成);NC膜(膜孔徑0.45 μm)(PALL公司);大腸桿菌JM-109(甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院提供);pMD18-T Vector系統(tǒng)(TaKaRa公司);［α-32P］dATP(北京福瑞生物工程公司);PCR所用試劑(上海生物工程公司);其他試劑均為國外或國產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 HIV-P24特異性寡核苷酸篩選:1)篩選:將5 μL HIV-P24(1 g/L)點(diǎn)至圓形 NC膜(半徑為0.2 cm)中心，待NC膜干燥后，置于0.5 mL的離心管(篩選管)，加入50 μL封閉液(含5%脫脂奶粉、100 g/L鮭魚精 DNA的 PBS溶液)37℃孵育2 h。同時(shí)設(shè)立不加P24的NC膜為反篩管。用含0.05%Tween-20的PBS溶液分別洗滌篩選管和反篩管3次，每次3 min。用50 μL 10×緩沖液溶解寡核苷酸庫，95℃變性5 min，降至4℃。首先把變性后的庫加入反篩管，37℃孵育1 h。吸出反篩管中的庫，加入篩選管，37℃孵育1 h。篩選管和反篩管分別用含0.05%Tween-20的 PBS溶液洗滌 3次，每次3 min。然后兩管中分別加入200 μL洗脫緩沖液(20 mmol/L Tris-HCl，4 mol/L 異 硫 氰 酸 胍，1 mmol/L DTT，pH 8.3)，于80 ℃水浴15 min，立即降到4℃，吸取兩管中的洗脫液，酚氯仿抽提、乙醇沉淀回收DNA，用50 μL超純水溶解待用。2)PCR鑒定回收到的DNA:從上述回收產(chǎn)物中取10 μL為模板，配置100 μL PCR體系:10×擴(kuò)增緩沖液(不含MgCl2)10 μL，Mg2+(25 mmol/L)5 μL，4 種 dNTP 混合物(每種2.5 mmol/L)8 μL，引物 P9(25 mmol/L)1 μL，引物 P12(25 mmol/L)1 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板10 μL，加超純水至100 μL。進(jìn)行 PCR擴(kuò)增:94℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72℃ 30 s，共21個(gè)循環(huán)。每3個(gè)循環(huán)取樣10 μL，進(jìn)行非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)比篩選管和反篩管回收到的DNA的量，確定寡核苷酸對(duì)P24的富集情況。把篩選管回收到的ssDNA制備成dsDNA。3)不對(duì)稱PCR制備ssDNA:從 dsDNA產(chǎn)物中取10 μL為模板，配置100 μL PCR體系:10×擴(kuò)增緩沖液(不含 MgCl2)10 μL，Mg2+(25 mmol/L)5 μL，4 種 dNTP 混合物(每 種 2.5 mmol/L)8 μL，引 物 P9(25 mmol/L)2 μL，Taq DNA 聚合酶0.5 μL，模板10 μL，加超純水至100 μL。進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增:94℃ 30 s，55℃30 s，72℃ 30 s，共30個(gè)循環(huán)。每隔5個(gè)循環(huán)取樣10 μL，進(jìn)行變性聚丙烯酰胺凝膠電泳，確定制備ss-DNA的最佳PCR循環(huán)數(shù)，制備ssDNA。ssDNA經(jīng)切膠純化后，作為次級(jí)庫，用于下一輪篩選。

1.2.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定P24-ssDNA復(fù)合物:最后一輪篩選得到的寡核苷酸用［α-32P］dATP標(biāo)記，在10 μL 10×緩沖液中與5 μL HIV-P24 37 ℃孵育1 h結(jié)合，采用瓊脂糖凝膠電泳(1.5%W/V瓊脂糖，1×TAE緩沖體系，穩(wěn)壓80 V)分離P24-ssDNA復(fù)合物，同時(shí)設(shè)置P24和ssDNA兩個(gè)參照。放射自顯影和考馬斯亮藍(lán)染色后，觀察P24-ssDNA復(fù)合物的阻滯條帶。

1.2.3 寡核苷酸轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109:將篩選到的寡核苷酸制備成 dsDNA，并切膠純化。按照pMD18-T Vector試劑盒操作，連接 dsDNA到pMD18-T Vector，轉(zhuǎn)化大腸桿菌JM-109，菌液涂布在含有氨芐抗生素的LB固體培養(yǎng)基上。待長出克隆后，挑取單克隆培養(yǎng)，采用通用引物M13-47和特異性引物P9/P12交錯(cuò)PCR法鑒定陽性克隆。

1.2.4 Dot-blot篩選與HIV-P24結(jié)合的配體:將已鑒定的陽性克隆菌液利用不對(duì)稱PCR制備成［α-32P］dATP標(biāo)記的ssDNA。按方法1.2.1中1)所述，制備結(jié)合有P24的NC膜，同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照。將32P-ssDNA加到制備好的NC膜上，37℃孵育2 h后，用含0.05%Tween-20的PBS溶液洗膜。NC膜干燥后進(jìn)行放射自顯影，觀察32P-ssDNA與P24的結(jié)合情況。用 Image J軟件對(duì)Dot-blot結(jié)果進(jìn)行吸光度分析，將與P24結(jié)合程度較好的寡核苷酸測(cè)序。

1.2.5 核酸適配體特異性檢測(cè):按方法1.2.1中1)所述，制備分別結(jié)合有 HIV-P24(2 μL)、人血清白蛋白(2 μL)、牛血清白蛋白(2 μL)、脫脂奶粉(2 μL)的NC膜。不對(duì)稱 PCR制備［α-32P］dATP標(biāo)記的配體32P-ssDNA，Dot-blot檢測(cè)配體32P-ssDNA與各種蛋白的結(jié)合情況。

2 結(jié)果

2.1 HIV-P24特異性寡核苷酸篩選結(jié)果

在篩選過程中，Dot-blot鑒定第 1、4、8、12 輪的次級(jí)庫寡核苷酸對(duì)P24的富集。Image J軟件分析顯示，反篩管相對(duì)參照值(用 PBS為洗滌液的Dot-blot吸光度值)的結(jié)合百分比分別為18.9%、16.3%、15.1%和14.3%;篩選管相對(duì)參照值的結(jié)合百分比分別為21.4%、25.2%、38.4%和51.7%(圖1)，寡核苷酸對(duì)HIV-P24逐步得到富集。第12輪篩選時(shí)，電泳檢測(cè)寡核苷酸對(duì)P24的富集效果見圖2。

圖1 寡核苷酸對(duì)P24的富集Fig 1 The enrichment of oligonucleotides to P24

2.2 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)

P24-ssDNA復(fù)合物在電泳中明顯受到阻滯(圖3)。

2.3 寡核苷酸轉(zhuǎn)化大腸桿菌結(jié)果

鑒定結(jié)果顯示，48個(gè)菌液均為陽性，目的片段有19個(gè)正向插入載體，有29個(gè)呈反向插入。

2.4 Dot-blot篩選P24核酸適配體

Image J吸光度值分析顯示，8號(hào)、15號(hào)、18號(hào)、26號(hào)和33號(hào)菌液制備的32P-ssDNA與P24結(jié)合程度較好(表1，圖4)。

圖2 寡核苷酸富集效果Fig 2 The enrichment effect of oligonucleotides

圖3 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)放射自顯影和考馬斯亮蘭染色Fig 3 EMSA assay by radioautography and Coomassie brilliant blue staining

2.5 核酸適配體測(cè)序結(jié)果

5個(gè)結(jié)合較強(qiáng)的候選P24核酸適配體測(cè)序結(jié)果見表2。

2.6 核酸適配體特異性檢測(cè)結(jié)果

特異性結(jié)合實(shí)驗(yàn)顯示，18和26號(hào)適配體與HIV-P24有明顯結(jié)合(圖5)，而與其他蛋白無顯著結(jié)合。

表1 Dot-blot吸光度值分析Table 1 The absorbency analysis of Dot-blot

3 討論

1990年Gold和Ellington等提出核酸適配體技術(shù)［10－11］，核酸適配體以其優(yōu)良的特性在醫(yī)學(xué)診斷領(lǐng)域的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究備受關(guān)注。研究人員利用核酸適配體可通過PCR進(jìn)行擴(kuò)增的特點(diǎn)建立了“鄰近連接法”檢測(cè)技術(shù)［12］，日本學(xué)者在2009年報(bào)道了immuno-aptamer PCR技術(shù)檢測(cè) VEGF［13］。最近，基于核酸適配體的激活式分子探針用于腫瘤活細(xì)胞檢測(cè)和活體成像的新方法被重點(diǎn)報(bào)道［14］。這些檢測(cè)方法因其具有高特異性和高靈敏度，為疾病相關(guān)標(biāo)志物分析檢測(cè)、病變細(xì)胞檢測(cè)、腫瘤成像診斷提供了新的思路，具有廣泛的臨床前實(shí)驗(yàn)以及臨床應(yīng)用前景。

目前，國際醫(yī)學(xué)界越來越重視對(duì)P24的檢測(cè)，把血液中P24的測(cè)定作為艾滋病診斷和病情監(jiān)控的一個(gè)重要指標(biāo)，但是臨床上檢測(cè)P24的主要方法仍然是ELISA［15］，有關(guān)核酸適配體用于P24檢測(cè)的研究并未見報(bào)道。如果能夠?qū)⒑怂徇m配體應(yīng)用于P24檢測(cè)，作為HIV核酸檢測(cè)的輔助診斷方式，對(duì)艾滋病的確診和病情監(jiān)控將具有一定臨床意義。

圖4 32P-ssDNA與P24的Dot blot結(jié)果Fig 4 The result of Dot blot between P24 and different32P-ssDNA

表2 測(cè)序得到的核酸適配體序列Table 2 Sequences of the aptamers after sequencing

圖5 適配體32P-ssDNA與不同靶標(biāo)結(jié)合結(jié)果Fig 5 Binding result of the aptamer32P-ssDNA with different targets by Dot-blot

本研究以P24為篩選靶，利用經(jīng)典的SELEX技術(shù)經(jīng)過12輪篩選，獲得了針對(duì)P24富集的寡核苷酸，凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)鑒定了寡核苷酸與P24的結(jié)合。Dot-blot分析明確了寡核苷酸配體與P24的結(jié)合情況，并對(duì)配體的特異性進(jìn)行了檢測(cè)，最終獲得了特異性識(shí)別和結(jié)合P24的核酸適配體。這為核酸適配體用于P24檢測(cè)提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，為P24的檢測(cè)提供一種新思路。

［1］熊祝嘉．ELISA檢測(cè)p24抗原用于診斷HIV感染的研究現(xiàn)狀［J］．實(shí)用醫(yī)技雜志，2007，14:166－168．

［2］劉魚，王憬惺，黃毅．HIV-1p24抗原檢測(cè)方法及應(yīng)用研究進(jìn)展［J］．中國輸血雜志，2009，22:63－67．

［3］Kulbachinskiy AV．Methods for selection of aptamers to protein targets［J］．Biochemistry，2007，72:1505 －1518．

［4］Ireson CR，Kelland LR．Discovery and development of anticancer aptamers［J］．Mol Cancer Ther，2006，5:2957 －2962．

［5］Soontornworajit B，Wang Y．Nucleic acid aptamers for clinical diagnosis:cell detection and molecular imaging［J］．A-nal Bioanal Chem，2011，399:1591－1599．

［6］謝海燕，陳薛釵，鄧玉林．核酸適配體及其在化學(xué)領(lǐng)域的相關(guān)應(yīng)用［J］．化學(xué)進(jìn)展，2007，6:1026－1033．

［7］吳崔晨，胡佳，鄒遠(yuǎn)，等．核酸適體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用［J］．化學(xué)進(jìn)展，2010，22:1518－1530．

［8］Keefe AD，Pai S，Ellington AD．Aptamers as therapeutics［J］．Nat Rev Drug Discovery，2010，9:537－550．

［9］Liao SQ，Liu YQ，Zeng JY，et al．Aptamer-based sensitive detection of target molecules via RT-PCR signal amplication［J］．Bioconjugate Chem，2010，21:2183－2189．

［10］Tuerk C，Gold L．Systematic evolution of ligands by exponential enrichment:RNA ligands to bacteriophage T4DNA polymerase［J］．Science，1990，249:505 －510．

［11］Ellington AD，Szostak JW．In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands［J］．Nature，1990，346:818－822．

［12］Fredriksson S，Gullberg M，Jarvius J，et al．Protein detection using proximity-dependent DNA ligation assays［J］．Nat Biotechnol，2002，20:473 －477．

［13］Yoshida Y，Horii K，Sakai N，et al．Antibody-specific aptamer-based PCR analysis for sensitive protein detection［J］．Anal Bioanal Chem，2009，395:1089－1096．

［14］Shi H，He XX，Wang KM，et al．Activatable aptamer probe for contrast-enhanced in vivo cancer imaging based on cell membrane protein-triggered conformation alteration［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2011，108:3900－3905．

［15］Constantine NT，Zink H．HIV testing technologies after two decodes of evolution［J］．Indian J Med Res，2005，121:519－538．

Screening of aptamers to HIV-P24

ZHANG Ning1，MAO Ai-hong2，MA Jin2，LIAO Shi-qi2*，ZHANG Li-qiong1，WANG Xiao-qing2，MA Jun1

(1.College of Life Science and Engineering，Lanzhou University of Technology，Lanzhou 730050;2.Institute of Gansu Medical Science Research，Lanzhou 730050，China)

ObjectiveTo screen aptamers to HIV-P24 through SELEX technique for the diagnosis and therapy of AIDS．MethodsWith recombinant P24 for the screening target，oligonucleotides binding to HIV-P24 were screened from a random oligonucleotide library through SELEX technique．The binding capacity between oligonucleotides obtained from the 12th round of screening and HIV-P24 was identified via electrophoretic mobility shift assay(EMSA)．The aptamers strongly binding to HIV-P24 were screened and the recognition specificity of aptamers for HIV-P24 was detected by Dot-blot method．ResultsFive aptamers with high affinity to HIV-P24 were obtained with different sequences．The binding specificity showed that No．18 and No．26 apatmers only bound to HIV-P24，not to human serum albumin，bovine serum albumin and skimmed milk powder．ConclusionsTwo aptamers specially binding to HIV-P24 were obtained，and thus provides an experimental basis for the diagnosis and treatment of AIDS by utilizing aptamer of HIV-P24．

SELEX technique;HIV-P24;aptamer

R 319

A

1001-6325(2012)09-0987-05

2011－08－16

2011－12－05

國家自然科學(xué)基金(30271219，30960104，81060180);國家中小企業(yè)創(chuàng)新基金(06C26226200591);甘肅省重大研發(fā)項(xiàng)目(GKSOU-B06-10，GKS031030)

*通信作者(corresponding author):lshiqi@126．com

志謝:衷心感謝甘肅省醫(yī)學(xué)科學(xué)研究院醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)研究中心的全體員工和同學(xué)及蘭州理工大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院。