犬瘟熱病毒核衣殼蛋白基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)及其抗原性分析

畢振威 ，王永山，范紅結(jié)

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物疫病診斷與免疫重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 國家獸用生物制品工程技術(shù)研究中心，南京 210014；2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，南京 210095)

犬瘟熱（canine distemper, CD）是由犬瘟熱病毒（Canine distemper virus, CDV）感染犬、貂、浣熊和狐等食肉動(dòng)物引起發(fā)病的一種致死性傳染病。CDV弱毒疫苗的使用曾有效地防控了此病，但在過去的20年，犬瘟熱疫情重新爆發(fā)和大規(guī)模流行，而且已跨越物種限制，感染海豹、海獅等水生動(dòng)物和靈長類動(dòng)物[1]。2008年中國大陸出現(xiàn)了人工飼養(yǎng)恒河猴感染并死于犬瘟熱的病例[2]。

CDV屬于副粘病毒科麻疹病毒屬，病毒顆粒主要由核衣殼蛋白(nucleocapsid protein, N)、融合蛋白(fusion protein, F)、血凝或附著蛋白(heamagg lutinin protein, H)、基質(zhì)膜蛋白(matrix protein, M)、大蛋白(large protein, L)和磷蛋白(phosphoprotein, P)構(gòu)成[3]。N蛋白是具有免疫原性的主要結(jié)構(gòu)蛋白，病毒感染早期，即可強(qiáng)烈刺激機(jī)體產(chǎn)生大量的特異性抗體[4]。在動(dòng)物免疫功能低下，H蛋白和F蛋白的特異性抗體低于檢測(cè)水平時(shí)，N蛋白的特異性抗體仍能被檢測(cè)到[5]。因此，進(jìn)行CDV血清學(xué)診斷時(shí)，尤其在CDV早期感染階段，與病毒其它結(jié)構(gòu)蛋白相比N蛋白是免疫學(xué)檢測(cè)中理想的靶抗原。

CDV只有一個(gè)血清型，但存在CDV毒株之間因基因突變導(dǎo)致的抗原性差異[6-10]。本實(shí)驗(yàn)前期對(duì)引起免疫犬非典型臨床癥狀的CDV NJ01的N基因進(jìn)行了序列分析，并在大腸桿菌中表達(dá)[10]。由于犬血清中自然存在著大腸桿菌抗體，因此，用大腸桿菌表達(dá)的重組N蛋白用于CDV抗體ELISA檢測(cè)時(shí)，需要進(jìn)行嚴(yán)格的純化，其推廣應(yīng)用有較大的局限性。鑒于此，本實(shí)驗(yàn)選用桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，將CDV NJ01的N基因在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，探索該重組N蛋白抗原在CDV抗體檢測(cè)中的應(yīng)用前景。

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒、細(xì)胞、菌種和病毒含有6×His標(biāo)簽的桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)供體質(zhì)粒pFastBacHTA、含有Bacmid和Helper plasmid的E.coliDH10Bac以及Sf9昆蟲細(xì)胞均購自Invitrogen公司；pMD18-T simple Vector購自TaKaRa公司；E.coliDH5α由本實(shí)驗(yàn)室保存；CDV NJ01毒株系由本實(shí)驗(yàn)室從表現(xiàn)為非典型犬瘟熱臨床癥狀病犬的肺與肝臟組織中分離鑒定，能在vero細(xì)胞上穩(wěn)定增殖和傳代[10]。

1.2 主要試劑MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、X-gal、IPTG均購自TaKaRa公司；BAC/PAC DNA分離試劑盒購自O(shè)mega公司；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司；胎牛血清、Grace’s昆蟲細(xì)胞培養(yǎng)基購自Gibco公司；FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司；Ni-NTA His-Bind Resin親和層析柱購自Novagen公司；兔抗犬IgG抗體和HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG抗體為本實(shí)驗(yàn)室制備；犬CDV陽性血清由犬瘟熱、腺病毒2型、細(xì)小病毒病、副流感四聯(lián)活疫苗-犬冠狀病毒病滅活疫苗（美國富道動(dòng)物保健公司產(chǎn)品）5次免疫犬獲得；5份CDV疫苗免疫犬血清和3份犬CDV陰性血清由公安部南京警犬研究所惠贈(zèng)；5份臨床感染CDV犬血清取自南京農(nóng)業(yè)大學(xué)博研寵物醫(yī)院。

1.3 N基因的RT-PCR擴(kuò)增和克隆根據(jù)GenBank已發(fā)表CDV的N基因編碼區(qū)和供體質(zhì)粒pFastBacHTA閱讀框的多克隆位點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，分別在上游引物和下游引物加入EcoR I和Hind III酶切位點(diǎn)，6×His標(biāo)簽位于重組N蛋白的N端。上游引物F：5′-CCGGAATTCATGGCTAGCCTTC TCAAGAGCCTC-3′（下劃線為EcoR I位點(diǎn)）；下游引物R：5′-CCCAAGCTTTTAATTGAGTAG CTCTCTATC-3′（下劃線為HindIII位點(diǎn)）。

重組桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒鑒定引物：M13F（17）：5′-GTTTTCCCAGTCACGAC-3′；M13R（17）：5′-CAGGAAACAGCTATGAC-3′。以上引物由Invitrogen公司合成。

將CDV接種vero細(xì)胞，病變后反復(fù)凍融3次取 裂 解 液， 按 TRIZOL?Reagent (InvitrogenTMLife technologies)試劑使用方法提取RNA。用RT-PCR方法擴(kuò)增CDV的N基因。回收N基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，將其與pMD18-T simple Vector連接，轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞。用1.5%瓊脂LB平板（含氨芐青霉素100 mg/L）進(jìn)行藍(lán)白斑篩選，挑白色單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒，用EcoR I和Hind III雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定，獲得陽性克隆質(zhì)粒pMD-N，測(cè)序由Invitrogen公司完成。

1.4 N基因重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建將pMD-N和pFastBacHTA分別用EcoRI與HindIII雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后分別回收N基因和載體片段，DNA凝膠回收試劑盒純化，T4DNA 連接酶連接并轉(zhuǎn)化E.coliDH5α感受態(tài)細(xì)胞，用1.5%瓊脂LB平板（含氨芐青霉素100 mg/L）篩選轉(zhuǎn)化菌，挑單菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，用MiniBEST質(zhì)粒純化試劑盒提取質(zhì)粒，EcoR I與Hind III雙酶切鑒定，獲得重組供體質(zhì)粒pFastBac-N。

1.5 N基因重組Bacmid DNA的獲得用重組供體質(zhì)粒pFastBac-N轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞E.coliDH10Bac，在LB培養(yǎng)基中37℃、220 r/min振搖4 h，涂布在LB瓊脂平板（含有卡那霉素50 mg/L、慶大霉素7 mg/L、四環(huán)素10 mg/L以及X-gal 100 mg/L和IPTG 40 mg/L），37℃培養(yǎng)24 h。挑白色單菌落接種于含有上述三種抗生素的LB中，37℃振搖培養(yǎng)24 h，用BAC/PAC DNA 分離試劑盒提取重組Bacmid DNA。同步提取E.coliDH10Bac中的Bacmid DNA作為空白對(duì)照。分別用N基因上游引物F和M13R（17）以及M13F（17）和M13R（17）兩種引物組合，PCR鑒定重組Bacmid DNA，獲得含N基因的重組Bacmid DNA，命名為rBacmid-N。

1.6 N基因重組桿狀病毒的獲得在轉(zhuǎn)染前1 d，用對(duì)數(shù)生長期的Sf9昆蟲細(xì)胞在6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中制備單層細(xì)胞。將rBacmid-N按Lipofectamine2000使用說明書轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染時(shí)棄去舊培養(yǎng)液，用無血清無抗生素的Grace’s液洗滌細(xì)胞。然后用孵育好的rBacmid-N和Lipofectamine2000混合物轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞單層，在27℃作用5 h后棄去轉(zhuǎn)染混合物，每孔加入含10%血清及抗生素的Grace’s完全培養(yǎng)液，置27℃繼續(xù)培養(yǎng)。每天觀察病變，直到細(xì)胞病變達(dá)90%時(shí)，收集細(xì)胞及上清液，在Sf9昆蟲細(xì)胞上繼續(xù)傳代2次后進(jìn)行鑒定，獲得第3代（P3代）重組桿狀病毒vBacmid-N。同步用未插入外源基因的Bacmid質(zhì)粒和單用轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染的Sf9細(xì)胞作為對(duì)照。

1.7 Western blot分析將P3代vBacmid-N感染的Sf9細(xì)胞、Bacmid轉(zhuǎn)染產(chǎn)生的野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞和正常的Sf9細(xì)胞用0.01 mol/L PBS（pH7.2）離心洗滌2次后，用PBS重懸加入5×SDS-Loading Buffer，按常規(guī)方法進(jìn)行SDSPAGE電泳分析，并將其轉(zhuǎn)印到硝酸纖維素膜（NC膜）上，用5%脫脂奶粉4℃封閉過夜，洗滌后加犬CDV高免血清室溫作用1 h，然后在洗滌的NC膜中加入HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG抗體，作用1 h后洗滌，DAB底物顯色。

1.8 間接免疫熒光試驗(yàn)（indirect immunof l uorescent assay, IFA） 檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行。將P3代重組桿狀病毒vBacmid-N接種到Sf9細(xì)胞，培養(yǎng)72 h后用0.01 mol/L PBS（pH7.2）洗滌2次；加入－20℃預(yù)冷的無水乙醇（1 mL/孔），4℃固定30 min，用PBS洗滌3次，拍干；加入100倍稀釋的犬抗CDV高免血清（200 μL/孔），37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，拍干；加入兔抗犬IgG抗體（200 μL/孔），37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，拍干；加入50倍稀釋的FITC標(biāo)記的羊抗兔IgG抗體工作液（200 μL/孔），37℃孵育1 h，PBS洗滌5次，置于熒光顯微鏡下觀察。同步設(shè)立野生桿狀病毒感染Sf9細(xì)胞和正常Sf9細(xì)胞為對(duì)照。

1.9 間接 ELISA按 Ni-NTA His-Bind Resin 親和層析柱使用說明純化N蛋白。以純化的重組N蛋白為包被抗原，采用方陣試驗(yàn)方法優(yōu)化抗原包被濃度、被檢血清稀釋和HRP標(biāo)記的兔抗犬IgG，建立CDV抗體間接ELISA檢測(cè)方法。對(duì)5份CDV疫苗免疫犬血清、5份臨床感染CDV犬血清和3份犬CDV陰性血清進(jìn)行檢測(cè)，重復(fù)3次，檢驗(yàn)重組N蛋白的特異性與穩(wěn)定性。

2 結(jié)果

2.1 N基因的擴(kuò)增與克隆從感染CDV的vero細(xì)胞凍融物中提取RNA，RT-PCR方法擴(kuò)增出約1600 bp的片段，與CDV的N基因理論值（1572 bp）相符。將N基因與pMD18-T simple Vector連接構(gòu)建成重組克隆質(zhì)粒pMD-N，用EcoRI與HindIII雙酶切，可得到約1600 bp的N基因片段和3000 bp的克隆載體片段（圖1）。測(cè)序結(jié)果(已錄入GeneBank中，序列號(hào)為JF965338)在GenBank中比對(duì)分析，顯示為CDV的N基因。

2.2 N基因重組供體質(zhì)粒的構(gòu)建將N基因與pFastBacHTA載體片段連接，獲得含N基因的重組供體質(zhì)粒pFastBac-N，經(jīng)EcoRI和Hind III雙酶切，用1%瓊脂糖凝膠電泳可見2條長度分別約1600 bp和5000 bp的條帶，與N基因和pFastBacHTA片段的理論值相符合（圖1）。

圖1 CDV N基因重組質(zhì)粒的酶切鑒定Fig.1 Identification of the recombinant plasmid pMD-N and pFastBac-N

2.3 N基因重組Bacmid DNA的獲得用pFastBac-N轉(zhuǎn)化DH10Bac感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑和三種抗性篩選，挑白色菌落擴(kuò)大培養(yǎng)，提取含N基因的重組Bacmid DNA。分別用N基因F、M13R（17）引物組合和M13F（17）、M13R（17）引物組合進(jìn)行PCR擴(kuò)增鑒定，得到了2189 bp和3959 bp的預(yù)期大小片段。對(duì)照質(zhì)粒Bacmid由于缺少目的基因，無法與N基因F特異結(jié)合而無條帶出現(xiàn)，而用M13F（17）和M13R（17）只擴(kuò)增出307bp的片段（圖2)，表明成功獲得含N基因的重組Bacmid DNA（簡稱：rBacmid-N）。

2.4 N基因重組桿狀病毒的獲得將鑒定好的rBacmid-N用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞，5 d后轉(zhuǎn)染孔可見部分細(xì)胞變圓變大，d6細(xì)胞病變達(dá)90%以上。收集病變細(xì)胞及上清，1500 r/min離心10 min，上清液即為含N基因的重組桿狀病毒vBacmid-N原液（P1代），繼續(xù)傳代2次，獲得高效價(jià)的P3代重組桿狀病毒。

圖2 CDV N 基因重組Bacmid DNA（rBacmid-N）的PCR鑒定Fig.2 Analysis of recombinant Bacmid DNA (rBacmid-N)by PCR

2.5 Western blot分析對(duì)P3代vBacmid-N感染的Sf9細(xì)胞培養(yǎng)物進(jìn)行SDS-PAGE，用Western blot分析，在62 kDa處可見一條特異蛋白帶，與重組N蛋白的理論值相符合，表明重組N蛋白在昆蟲細(xì)胞中表達(dá)，并具有CDV抗原反應(yīng)性。正常Sf9細(xì)胞和野生桿狀病毒感染的Sf9細(xì)胞均無特異的蛋白帶（圖3）。

2.6 IFA檢測(cè)在IFA試驗(yàn)中，vBacmid-N感染的Sf9細(xì)胞呈現(xiàn)較強(qiáng)的熒光，而正常Sf9細(xì)胞和Baculovirus感染的sf9細(xì)胞均沒有熒光（圖4）。

2.7 間接ELISA將純化的重組N蛋白進(jìn)行SDSPAGE，用凝膠圖像分析軟件BandScan5.0分析，純度達(dá)80%（圖3）。以純化的重組N蛋白為包被抗原，采用方陣試驗(yàn)方法確定的抗原包被濃度為1 mg /L，被檢血清的稀釋度為1:200。檢測(cè)5份CDV疫苗免疫犬血清和5份臨床感染CDV犬血清檢測(cè)，其A450值均大于0.4，其中有6份高于0.8；而3份犬CDV陰性血清的A450值均小于0.05，顯示出了良好的抗原特異性和穩(wěn)定性。

圖3 vBacmid-N感染Sf 9細(xì)胞SDS-PAGE和Western blot分析結(jié)果Fig.3 Analysis of vBacmid-N infected sf9 cells by SDS-PAGE and Western blot

圖4 vBacmid-N感染的Sf9昆蟲細(xì)胞IFA檢測(cè)結(jié)果Fig.4 IFA detection result of Sf9 cells infected with vBacmid-N by IFA

3 討論

目前，免疫接種是防控CD的有效方法，但免疫效果并非總是有效，世界許多國家均有免疫犬爆發(fā)CD疫情或發(fā)病的報(bào)道[11]，其臨床癥狀也呈現(xiàn)多樣化。我們?cè)谂R床病例中發(fā)現(xiàn)了免疫犬感染CDV，表現(xiàn)為CD的非典型臨床癥狀。盡管免疫失敗與疫苗質(zhì)量、母源抗體干擾、動(dòng)物免疫狀態(tài)和應(yīng)激等因素相關(guān)，但是CDV毒株基因變異導(dǎo)致其抗原性和致病性與疫苗株存在差異可能也是一個(gè)重要因素[6]。CDV的N蛋白是病毒的主要結(jié)構(gòu)蛋白，又是免疫原性較強(qiáng)的蛋白，許多CDV分離毒株的N基因發(fā)生變異已被證實(shí)[9-13]。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)引起免疫犬表現(xiàn)非典型CD臨床癥狀的CDV NJ01病毒N基因進(jìn)行了序列分析，該非典型CDV具有強(qiáng)毒株的分子特征[10]。

ELISA方法是檢測(cè)CDV血清抗體的一種快速、敏感和特異方法，傳統(tǒng)的CDV抗體ELISA檢測(cè)方法，通常用全病毒作為包被抗原，但CDV在Vero細(xì)胞培養(yǎng)中的病毒滴度較低，并且需要采用超速離心等復(fù)雜的純化技術(shù)，而且病毒蛋白不穩(wěn)定[14]，限制了該方法的廣泛應(yīng)用。姜騫等[15]和Latha等[16]原核表達(dá)N蛋白，建立間接ELSIA血清學(xué)診斷方法。Messling[14]等利用桿狀病毒重組表達(dá)的CDV野生分離株(2544/Han95)的N蛋白建立捕獲夾心ELISA，用于檢測(cè)犬血清中的IgM和IgG。

為了制備便于檢測(cè)試劑標(biāo)準(zhǔn)化的非典型CDV抗體檢測(cè)抗原，本實(shí)驗(yàn)室曾將非典型CDV NJ01的N基因在大腸桿菌中進(jìn)行了高效表達(dá)，由于表達(dá)產(chǎn)物主要以包涵體的形式存在，重組N蛋白的純化與復(fù)性比較繁瑣。此外，用大腸桿菌表達(dá)的蛋白作抗原檢測(cè)動(dòng)物體內(nèi)的抗體，常因純化的抗原中存在大腸桿菌成份污染而導(dǎo)致出現(xiàn)假陽性。桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)具有與高等細(xì)胞類似的翻譯后修飾系統(tǒng)，其表達(dá)外源蛋白的生物學(xué)活性與天然產(chǎn)物極其相似，能夠保持較好的抗原性和免疫原性[17]。自然狀態(tài)下，犬體內(nèi)不存在昆蟲細(xì)胞抗體，因此，本研究選用桿狀病毒/昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)N蛋白作為CDV抗體檢測(cè)抗原，以期改善檢測(cè)方法的特異性與穩(wěn)定性。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在昆蟲細(xì)胞Sf9中表達(dá)的重組N蛋白，經(jīng)Western blot、IFA和間接ELSIA三種方法分析，均顯示了良好的抗原特異性，用該重組蛋白作為抗原建立的CDV血清抗體間接ELISA方法具有良好的特異性和穩(wěn)定性，優(yōu)于大腸桿菌表達(dá)的重組N蛋白。此外，用分離株CDV NJ01的N基因表達(dá)產(chǎn)物作為抗原，可能更適于本地區(qū)CDV血清抗體的檢測(cè)。該抗體檢測(cè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)化工作也在進(jìn)行之中。

[1] Takayama I, Kubo M, Takenaka A,et al.Pathological and phylogenetic features of prevalent canine distemper viruses in wild masked palm civets in Japan[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2009, 32(6): 539-549.

[2] Sun Z, Li A, Ye H,et al.Natural infection with canine distemper virus in hand-feeding Rhesus monkeys in China[J].Vet Microbiol, 2010, 141(3-4): 374-378.

[3] Chan K W, Hsieh H H, Wang H C,et al.Identification,expression and antigenic analysis of recombinant hemagglutinin proteins of canine distemper virus[J].J Virol Methods, 2009, 155(1): 18-24.

[4] Latha D, Geetha M, Ramadass P,et al.Development of recombinant nucleocapsid protein based IgM-ELISA for the early detection of distemper infection in dogs[J].Vet Immunol Immunopathol, 2007, 119(3-4): 278-286.

[5] Krakowka S, Olsen R, Confer A,et al.Serologic response to canine distemper viral antigens in gnotobiotic dogs infected with canine distemper virus[J].J Infect Dis, 1975,132(4): 384-392.

[6] Simon-Martínez J, Ulloa-Arvizu R, Soriano V E,et al.Identification of a genetic variant of canine distemper virus from clinical cases in two vaccinated dogs in Mexico[J].Vet J, 2008, 175(3): 423-426.

[7] Iwatsuki K, Tokiyoshi S, Hirayama N,et al.Antigenic differences in the H proteins of canine distemper viruses[J].Vet Microbiol, 2000, 71 (3-4): 281-286.

[8] Lan N T, Yamaguchi R, Inomata A,et al.Comparative analyses of canine distemper viral isolates from clinical cases of canine distemper in vaccinated dogs[J].Vet Microbiol, 2006, 115(1-3): 32-42.

[9] Keawcharoen J, Theamboonlers A, Jantaradsamee P,et al.Nucleotide sequence analysis of nucleocapsid protein gene of canine distemper virus isolates in Thailand[J].Vet Microbiol, 2005, 105(2): 137-142.

[10] 畢振威, 王永山, 范紅結(jié), 等.非典型犬瘟熱病毒核衣殼蛋白基因序列分析及其在大腸桿菌中的表達(dá)[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2011, 33(8): 625-629.

[11] Demeter Z, Palade E A, Hornyák A,et al.Controversial results of the genetic analysis of a canine distemper vaccine strain[J].Vet Microbiol, 2010, 142(3-4): 420-426.

[12] Masuda M, Sato H, Kamata H,et al.Characterization of monoclonal antibodies directed against the canine distemper virus nucleocapsid protein[J].Comp Immunol Microbiol Infect Dis, 2006, 29(2-3): 157-165.

[13] Yoshida E, Shin Y S, Iwatsuki K,et al.Epitopes and nuclear localization analyses of canine distemper virus nucleocapsid protein by expression of its deletion mutants[J].Vet Microbiol, 1999, 66(4): 313-320.

[14] von Messling V, Harder T C, Moennig V,et a1.Rapid and sensitive detection of immunoglobulin M(IgM)and IgG antibodies against canine distemper virus by a new recombinant nucleocapsid protein-based enzyme linked immunosorbent assay[J].J Clin Microbio1, 1999, 37(4):1049-1056.

[15] 姜騫,周潔,劉家森,等.犬瘟熱重組N蛋白抗原間接ELISA方法的建立及應(yīng)用[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報(bào), 2008,30(3): 225-232.

[16] Latha D, Geetha M, Ramadass P,et al.Evaluation of ELISA based on the conserved and functional middle region of nucleocapsid protein to detect distemper infection in dogs[J].Vet Microbiol, 2007, 120(3-4): 251-260.

[17] 歐陽偉,王永山,周宇,等.傳染性法氏囊病毒AH1株vp2基因在昆蟲細(xì)胞中的表達(dá)與應(yīng)用[J].生物工程學(xué)報(bào),2010, 26(5): 595-603.