日本血吸蟲蟲卵在BALB/c鼠肝臟各葉中的分布調(diào)查

朱傳剛，楊 藝，李小紅，劉 毅，徐玉梅

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241）

血吸蟲成蟲寄生于人或其他哺乳類動(dòng)物的腸系膜下靜脈，合抱的雌雄蟲交配產(chǎn)卵于小靜脈的小分支。部分蟲卵附著于腸壁，隨著糞便排出體外；而大部分蟲卵隨肝門靜脈血流入肝，抵達(dá)于門靜脈小分枝，在門管區(qū)等處形成蟲卵結(jié)節(jié)，故在肝表面和切面可見粟?；蚓G豆大結(jié)節(jié)。肝臟中血吸蟲蟲卵的負(fù)荷，不僅是血吸蟲病病理危害程度的一個(gè)重要指標(biāo)，也是現(xiàn)階段評估疫苗或藥物治療血吸蟲病效果的重要指標(biāo)之一。血吸蟲病研究的相關(guān)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)均以每克肝臟蟲卵數(shù)（肝臟EPG）作為重要評價(jià)指標(biāo)。蟲卵隨血流入肝后，由于肝臟各葉結(jié)構(gòu)不同、位置不同、血液的流體力學(xué)不同等因素，可能造成蟲卵在肝臟各分葉中的不同分布，所以，肝臟蟲卵計(jì)數(shù)時(shí)會(huì)因取樣位置不同而產(chǎn)生人為差異。為此，利用人工感染血吸蟲的方式，觀察并測定蟲卵在常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c小鼠肝臟各葉中的分布狀況，可以有助于明確蟲卵在肝臟中的分布。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物BALB/c雄性小鼠，6周齡，體重20～22 g，購自上海復(fù)旦大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心；陽性釘螺由江蘇省寄生蟲病研究所購進(jìn)，實(shí)驗(yàn)室人工培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 攻擊感染 用日本血吸蟲中國大陸株正?；钗豺式?jīng)小鼠腹部皮膚感染(貼片法)，每只小鼠感染約10～40條尾蚴不等。

1.2.2 小鼠肝臟的分葉與計(jì)數(shù)單位 于攻擊感染后6周，小鼠眼眶放血行頸部脫臼致死。取腹正中切口進(jìn)腹，向兩側(cè)牽開腹壁，將胃、脾等提出腹外，充分暴露肝臟，對肝臟行解剖學(xué)觀察，記錄肝的分葉及形態(tài)。然后，取下肝臟，稱重；切斷各葉肝蒂，分別稱取各葉肝重，計(jì)算肝臟各葉重量百分比。

1.2.3成蟲和蟲卵計(jì)數(shù) 實(shí)驗(yàn)小鼠取下肝臟后，門靜脈灌洗沖蟲，同時(shí)觀察肝臟血管內(nèi)是否有殘余血吸蟲，合并后計(jì)數(shù)配對成蟲和未發(fā)育童蟲。通過分葉順次肝切除建立小鼠肝臟的蟲卵計(jì)數(shù)取樣單位，各計(jì)數(shù)單位分別稱重后，將取樣的肝組織加生理鹽水定容至10 mL，然用組織粉碎機(jī)粉碎，加10 mL 5%KOH溶液65℃消化1 h，再用水稀釋1倍后，取100 μL進(jìn)行鏡檢。每份樣品計(jì)數(shù)3次，取3次計(jì)數(shù)的平均值，計(jì)算各葉肝臟蟲卵EPG及全肝EPG。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 將計(jì)算出的各個(gè)小鼠肝臟EPG分別輸入EXCEL中，用配對t檢驗(yàn)法檢測，分析各肝臟蟲卵計(jì)數(shù)單位的EPG之間以及同全肝的EPG的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 BALB/c小鼠小鼠肝臟的解剖和分葉特征小鼠肝臟位于橫膈下，呈分葉狀。游離肝臟周圍韌帶，完整切除肝臟，可見各葉之間界限明確，有部分相互重疊遮蓋。根據(jù)人類肝臟解剖分葉的特點(diǎn)和命名習(xí)慣，小鼠肝臟分為左外葉、左中葉、右中葉、右上葉、右下葉和尾狀葉[1](圖1)，其中尾狀葉又分為尾狀突、前尾狀葉和后尾狀葉。各葉之間的葉間裂十分明確。左外葉最大，呈扁平梭狀，遮蓋著尾狀葉，左中葉外側(cè)遮蓋了左外葉內(nèi)1/4，右中葉遮蓋了右上葉的左1/2，右上葉位于右下葉正上方[1]。測得感染血吸蟲42 d的BALB/c小鼠肝臟的重量為（2.23±0.26）g。

圖1 小鼠肝臟的在體解剖和離體解剖分葉觀察[1]Fig.1 Observation of mouse liver anatomy in vivo and in vitro[1]

2.2 肝臟蟲卵計(jì)數(shù)取樣單位的確定根據(jù)肝外形的溝裂可以看出，各分葉的外形、大小不一，有的較小。為保持每個(gè)蟲卵計(jì)數(shù)單位大于0.5 g，分別將肝左外葉、左中葉和右中葉、右上葉和右下葉以及尾狀葉合并在一起成為三個(gè)蟲卵計(jì)數(shù)取樣單位：中央葉（包含左中葉和右中葉）、右葉（包含右上葉和右下葉以及尾狀葉），左葉（左外葉），如圖2所示。根據(jù)上述自然肝裂以及人為分類方法，將肝臟的三個(gè)蟲卵計(jì)數(shù)取樣單位順次進(jìn)行解剖，分別稱量，并計(jì)算各蟲卵計(jì)數(shù)單位肝葉占肝質(zhì)量的百分比。結(jié)果分別為左葉：(0.86±0.12) g，中央葉：(0.61±0.08)g，右葉：(0.76±0.10)g。左葉較大，中央葉較小。左葉、中央葉、右葉三個(gè)蟲卵計(jì)數(shù)單位占肝全重的比例分別是：39%、27%、34%。

圖2 肝臟的三個(gè)蟲卵計(jì)數(shù)單位Fig.2 Three egg count units of livers

2.3 BALB/c種系小鼠血吸蟲蟲卵分布小鼠體內(nèi)血吸蟲負(fù)荷從2對到14對不等，肝臟EPG從13×103～91×103不等，蟲卵在小鼠肝臟的分布是不均勻的，見表1。在左葉、中央葉、右葉3個(gè)取樣樣本中的EPG分別為49.80×103±26.70×103，59.03×103±29.04×103，36.55×103±17.77 ×103。中央葉EPG最多，右葉最少，經(jīng)t檢驗(yàn)發(fā)現(xiàn)中央葉、右葉、左葉小鼠肝臟EPG的差異有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。在本試驗(yàn)的不同的血吸蟲負(fù)荷下，肝臟各葉EPG也基本符合上述規(guī)律，以右葉肝臟EPG為基準(zhǔn)，左葉、中央葉EPG最高分別是右葉EPG的1.73、2.24倍，平均為1.36倍，1.62倍。

按肝臟蟲卵負(fù)荷多少，即按EPG數(shù)量研究各肝葉中蟲卵的分布，各肝葉與全肝EPG的數(shù)量關(guān)系符合線性關(guān)系。

全肝EPG與中央葉EPG：y=1.1x-3，相關(guān)系數(shù)：0.9566，（y：全肝EPG，x：中央葉EPG）

全肝EPG與左葉EPG：y=1.2x+1.83，相關(guān)系數(shù)：0.9495，（y：全肝EPG，x：左葉EPG）

全肝EPG與右葉EPG：y=0.72x+2.1，相關(guān)系數(shù)：0.9195。（y：全肝EPG，x：右葉EPG）

BALB/c小鼠全肝EPG與各蟲卵計(jì)數(shù)單位的EPG進(jìn)行多重分析，也符合線性關(guān)系：y=0.31217 5x1+0.290515x2+0.386702x3-0.04607，相關(guān)系數(shù)為0.999。（y：全肝EPG，x1：左葉EPG，x2：：中央葉EPG，x3：右葉EPG）。

2.4 配對成蟲和肝臟EPG關(guān)系將每只小鼠肝臟EPG與灌洗沖蟲所獲蟲數(shù)一一對應(yīng)，如表1所示。配對成蟲平均為（9±3.64）對，每對配對成蟲對肝臟EGP的貢獻(xiàn)從3.67×103～6.5×103不等，平均貢獻(xiàn)是 5.28×103±0.98×103。

表1 肝臟EPG、蟲卵計(jì)數(shù)單位EPG以及蟲負(fù)荷的計(jì)數(shù)Table 1 Count of worm and EPG in every lobes of liver

3 討論

小鼠肝臟分葉命法名分為2 種，第1 種以1931年Higgins命名法為標(biāo)準(zhǔn)，以肝門為中心，按逆時(shí)針把肝臟分為：尾葉、左葉、中葉和右葉4 個(gè)主葉[2]；第2 種命名法，按上述順序分為：乳頭葉、左外葉、左內(nèi)葉、中葉、右葉和尾葉[3,4]。2009年，湯朝暉[1]根據(jù)人類肝臟解剖分葉的特點(diǎn)和命名習(xí)慣將小鼠肝臟分為左外葉、左中葉、右中葉、右上葉、右下葉和尾狀葉。我們依據(jù)小鼠肝臟的解剖特點(diǎn)，在參考湯朝暉的形態(tài)分葉基礎(chǔ)上同時(shí)考慮取樣的重量一致性，將小鼠肝臟各葉合并成三個(gè)可供計(jì)量的取樣單位，分別是：中央葉，包括左中葉和右中葉；右葉，包括右上葉和右下葉以及尾狀葉；左葉（左外葉）。這種取樣方法保證了肝臟的重量不至于偏差太大，并且順應(yīng)肝臟的自然分葉，易于辨認(rèn)和進(jìn)行分離。三個(gè)計(jì)數(shù)單位的重量雖然不一致，但基本保持在0.6～1 g之間，利于采取標(biāo)準(zhǔn)的定容、消化、稀釋操作。

肝臟EPG作為血吸蟲病的病理指標(biāo)以及血吸蟲治療、預(yù)防效果的判斷指標(biāo)，廣泛用于血吸蟲病相關(guān)研究中。研究發(fā)現(xiàn)，肝臟EPG的多少同體內(nèi)配對成蟲數(shù)有關(guān)，由于每對配對成蟲均可產(chǎn)卵，因此配對成蟲數(shù)越多，肝臟EGP越多。本試驗(yàn)結(jié)果也證實(shí)了這點(diǎn)。

由于肝臟解剖結(jié)構(gòu)等因素的影響，蟲卵進(jìn)入肝臟各葉的數(shù)量也會(huì)相應(yīng)不同。研究發(fā)現(xiàn)，依據(jù)我們提出的蟲卵肝臟計(jì)數(shù)取樣單位評價(jià)，肝葉之間EPG最大相差達(dá)2.24倍，差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以往評價(jià)肝臟EPG的數(shù)據(jù)沒有具體說明從肝臟哪個(gè)部分采集樣品進(jìn)行計(jì)數(shù)，而是籠統(tǒng)的采取“取樣1g左右”，“全肝消化”等方式進(jìn)行蟲卵計(jì)數(shù)，肝臟一般有2 g左右，取樣1 g左右可因取樣部位不同給數(shù)據(jù)帶來嚴(yán)重的誤差。全肝消化計(jì)數(shù)蟲卵比部分抽樣較為準(zhǔn)確，但血吸蟲研究中大多數(shù)動(dòng)物評價(jià)實(shí)驗(yàn)還需要行灌洗沖蟲，可因肝臟充水等因素而造成計(jì)數(shù)蟲卵不準(zhǔn)確。若在沖蟲前取全肝，可造成沖蟲效果下降。因此我們提出可通過沖蟲前取相同部分肝臟組織行蟲卵計(jì)數(shù)的方案，只要抽樣計(jì)數(shù)的部位確定，比較蟲卵EPG才具有科學(xué)意義。本研究同時(shí)發(fā)現(xiàn)，全肝EPG和計(jì)數(shù)取樣單位的EPG存在線性關(guān)系，因此提出，血吸蟲病研究過程涉及需要做肝臟EPG、減蟲率評估等操作時(shí)，可采用取完整的相同蟲卵計(jì)數(shù)取樣單位或簡單的采取相同肝葉的方法，這樣一方面可以得到比較正確的蟲卵計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)，另一方面不影響后繼的灌洗沖蟲。

肝臟中蟲卵分布的不同，主要是由于各肝葉的解剖結(jié)構(gòu)不同造成的。鼠肝臟每個(gè)分葉都有獨(dú)立的肝動(dòng)脈、門靜脈。門靜脈在肝門處分為3 支：左支進(jìn)入尾葉，頭支較粗分3 支進(jìn)入左葉和中葉，右支發(fā)出分支進(jìn)入右上葉和右下葉。右上葉和右下葉在根部有肝組織相連，所謂左、右半肝是門靜脈左及右支分別流注部分，由于這些管道的不同，造成蟲卵在各肝葉的沉積數(shù)量不一，進(jìn)而造成各肝葉的EPG的不同。我們依據(jù)肝臟的自然分葉，結(jié)合實(shí)驗(yàn)操作，提出的三個(gè)蟲卵計(jì)數(shù)取樣單位易于辨認(rèn)和分離。按本試驗(yàn)的方法取樣的肝臟重量適當(dāng)，是較好的考察肝臟蟲卵的方案，并可通過這種抽樣計(jì)數(shù)EPG的方法間接得到宿主肝臟的蟲卵負(fù)荷情況，對于比較固定葉之間的蟲卵負(fù)荷不失為一種較科學(xué)的方案。

[1] 湯朝暉,周露婷,謝志芳,等.利用分葉順次肝切除術(shù)建立小鼠肝臟大部切除后再生模型[J].第二軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào),2009, 30(5): 524-526

[2] Higgins G M, Anderson R M.Restoration of the liver of the white rat following partial surgical removal[J].AMA Arch Pathol, 1931, 12: 186-202.

[3] 呂毅, 潘承恩, 孟令忠, 等.SD大鼠肝臟及附屬管道的應(yīng)用解剖[J].西安醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào), 1998, 19(1): 70-73.

[4] 南開大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖學(xué)編寫組.實(shí)驗(yàn)動(dòng)物解剖學(xué)[M].北京: 人民教育出版社, 1980: 128-129.