巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲早熟株對(duì)8種抗球蟲藥的敏感試驗(yàn)

趙其平，李 婷，董 輝，韓紅玉，孔春林，姜連連，朱順海，黃 兵

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所 農(nóng)業(yè)部動(dòng)物寄生蟲學(xué)重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室，上海 200241）

雞球蟲病是嚴(yán)重危害養(yǎng)禽業(yè)的一種原蟲病，每年全球僅抗球蟲藥花費(fèi)高達(dá)20億美元。目前，預(yù)防該病的最主要方法為藥物防治，但事實(shí)證明，任何一種抗球蟲藥在使用一定時(shí)間后，都會(huì)引起球蟲產(chǎn)生抗藥性，只是不同類型藥物的抗藥性產(chǎn)生速度和耐藥的程度不同而已[1,2]。因此除了采用聯(lián)合用藥、穿梭用藥、輪換用藥等方法延緩耐藥性的產(chǎn)生外，免疫防治也必將在控制球蟲病中占領(lǐng)越來越重要的地位[3,4]。目前，國(guó)外已有幾種商品化球蟲疫苗在推廣使用，包括強(qiáng)毒疫苗Coccivac、Immucox和早熟弱毒疫苗Paracox、 Livacox等，在大規(guī)模試驗(yàn)和田間試驗(yàn)中表明都具有良好的免疫效力和免疫效果[5]。

本實(shí)驗(yàn)室早期對(duì)巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲進(jìn)行了早熟選育，并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了研究，結(jié)果表明與母株相比，兩個(gè)早熟株的致病力均明顯減弱，且具有良好的免疫原性和遺傳穩(wěn)定性[6,7]。本試驗(yàn)旨在對(duì)巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲早熟株的藥物敏感性進(jìn)行研究，為球蟲早熟株疫苗的研制提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物三黃雞購(gòu)自上海市郊區(qū)某孵化廠，出殼后即運(yùn)回本所動(dòng)物房隔離飼養(yǎng)。在無球蟲環(huán)境下喂養(yǎng)至14日齡，試驗(yàn)前連續(xù)2d檢查糞便，確認(rèn)無球蟲感染。

1.2 試驗(yàn)蟲株巨型艾美耳球蟲（Eimeria maxima）早熟株（資源號(hào)CAAS 2111314）和柔嫩艾美耳球蟲（E.tenella）早熟株（資源號(hào)CAAS 2111607），均由上海獸醫(yī)研究所球蟲病防治課題組實(shí)驗(yàn)室誘導(dǎo)獲得，其潛在期分別為107 h和118 h，比母株縮短了35 h和23 h[6,7]。兩個(gè)蟲株在試驗(yàn)前分別接種無球蟲雞繁殖獲得所需數(shù)量，置于2.5%重鉻酸鉀溶液孢子化后，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 試驗(yàn)藥物威迪，含0.5%地克珠利(Diclazuril)，批號(hào)20090418，用量1×10-6；美球，含10%氯苯胍（Robenidine），批號(hào)20090423，用量33×10-6；捕球，含6%癸氧喹酯（Decoquinate），批號(hào)20090407，用量20×10-6；尼克球，含25%尼卡巴嗪（Nicarbazin），批號(hào)20090505，用量125×10-6；禽康，含1%馬杜米星（Maduramicin），批號(hào)20090609，用量5.0×10-6。以上5種藥均由浙江匯能動(dòng)物藥品有限公司生產(chǎn)。腸球安，含25%二 硝 托 胺（Dinitolmide）， 批 號(hào) 20090526， 用量125×10-6，廣東高山動(dòng)物藥業(yè)有限公司生產(chǎn)。美路先，含45%鹽霉素 （Salinomycin），批號(hào)20090519，用量60×10-6，清遠(yuǎn)容大生物工程有限公司生產(chǎn)。球安，含15%拉沙洛西（Lasalocid），批號(hào)20090423，用量75×10-6，羅氏公司生產(chǎn)。將以上8種藥物分別按規(guī)定劑量拌入飼料中備用。

1.4 試驗(yàn)方法14日齡時(shí)，對(duì)雛雞逐只稱重分組，每個(gè)蟲株設(shè)10組：8個(gè)用藥感染組、1個(gè)感染不用藥組及1個(gè)不感染不用藥組，每組16只雞，每組2個(gè)重復(fù)。分組后用藥組即開始飼喂含藥飼料，直至試驗(yàn)結(jié)束。用藥1 d后（即15日齡），各感染組進(jìn)行人工感染球蟲早熟株，其中巨型艾美耳球蟲早熟株感染劑量為10×104個(gè)/羽，柔嫩艾美耳球蟲早熟株感染劑量為8×104個(gè)/羽。感染后5～7 d，每天收集糞便稱重，用麥?zhǔn)舷x卵計(jì)數(shù)法計(jì)算每克糞便卵囊數(shù)（OPG），統(tǒng)計(jì)每天每只雞排出的卵囊量。感染后7 d，逐只稱重、剖殺，取小腸中段或盲腸，按Johnson 等[8]所述方法進(jìn)行腸道病變記分。試驗(yàn)期間觀察記錄各組雞的精神狀況、食欲、飲水及糞便狀況。

1.5 判定指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)參照球蟲抗藥性判定指標(biāo)與標(biāo)準(zhǔn)[9]，即選用4項(xiàng)指標(biāo)綜合判定。最適抗球蟲活性百分比（percent of optimum anticoccidial activity，POAA），POAA＞50%為陰性，POAA≤50%為陽(yáng)性。病變記分減少率（reduction of lesion scores，RLS），RLS≥50%為陰性，RLS＜50%為陽(yáng)性。相對(duì)卵囊產(chǎn)量（relative oocyst production，ROP），ROP ＜15%為陰性，ROP≥15 %為陽(yáng)性?？骨蛳x指數(shù)（anticoccidial index，ACI），ACI≥160為陰性，ACI＜160為陽(yáng)性。陽(yáng)性用“＋”表示，陰性用“-”表示。按4項(xiàng)指標(biāo)中出現(xiàn)陽(yáng)性指標(biāo)的數(shù)量確定藥物敏感性程度，0～1個(gè)“＋”為敏感，2個(gè)“＋”為輕度敏感，3～4個(gè)“＋”為不敏感。

1.6 數(shù)據(jù)處理方法采用SAS8.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)各組的相對(duì)增重和病變記分進(jìn)行方差分析，其中P＜0.05為差異具有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，P＜0.01為差異具有非常顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 相對(duì)增重率、存活率、病變記分和卵囊量巨型艾美耳球蟲早熟株的試驗(yàn)結(jié)果見表1。由表可知，所有組均未出現(xiàn)死亡。在增重方面，鹽霉素、地克珠利和二硝托胺等組的相對(duì)增重率分別為64.83%、72.52%和73.43%，與感染對(duì)照組相當(dāng)，均明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.01）；其余組與健康對(duì)照組相當(dāng)。在病變方面，地克珠利、癸氧喹酯和拉沙洛西等組病變記分為0，其他組都出現(xiàn)不同程度的病變，但都明顯低于感染對(duì)照組（P＜0.01）。在卵囊產(chǎn)量方面，癸氧喹酯組未見有卵囊排出，其余各組均有少量卵囊排出，但產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于感染對(duì)照組。

表1 巨型艾美耳球蟲早熟株相對(duì)增重率、存活率、病變記分、卵囊量Table 1 Weight gain, survival rate, lesion scores and oocysts production of the precocious line of E.maxima

柔嫩艾美耳球蟲早熟株的試驗(yàn)結(jié)果見表2。由表可知，感染對(duì)照組死亡率為10%，其余各組均未出現(xiàn)死亡情況。在增重方面，鹽霉素和二硝托胺等組最差，相對(duì)增重率分別僅為51.06%和67.36%，與感染對(duì)照相當(dāng)，均明顯低于健康對(duì)照組（P＜0.05）。在病變方面，地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯和拉沙洛西等組病變記分為0，其余組出現(xiàn)輕微病變，但明顯低于感染對(duì)照組（P＜0.05）。在卵囊產(chǎn)量方面，地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯和拉沙洛西等組未有卵囊排出，其余各組均有少量卵囊排出，但產(chǎn)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于感染對(duì)照組。

表2 柔嫩艾美耳球蟲早熟株相對(duì)增重率、存活率、病變記分、卵囊量Table 2 Weight gain, survival rate, lesion scores and oocysts production of the precocious line of E.tenella

2.2 藥物敏感性結(jié)果 巨型艾美耳球蟲早熟株的藥物敏感性結(jié)果見表3。由表可知，地克珠利、二硝托胺、鹽霉素等組的3項(xiàng)指標(biāo)為陰性，判定為敏感；氯苯胍、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、馬杜米星和拉沙洛西組的4項(xiàng)指標(biāo)均為陰性，判定為敏感 。

表3 巨型艾美耳球蟲早熟株的藥物敏感性結(jié)果Table 3 Results of drug sensitivity of the precocious line of E.maxima

柔嫩艾美耳球蟲早熟株的藥物敏感性結(jié)果見表4。由表可知，鹽霉素組的2項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性，判定為輕度敏感；地克珠利、氯苯胍、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、馬杜米星和拉沙洛西等組4項(xiàng)指標(biāo)均為陰性，判定為敏感；二硝托胺組的POAA 1項(xiàng)指標(biāo)為陽(yáng)性，也判為敏感。

表4 柔嫩艾美耳球蟲早熟株的藥物敏感性結(jié)果Table 4 Results of drug sensitivity of the precocious line of E.tenella

3 討論

自20世紀(jì)30年代Levine[10]首次發(fā)現(xiàn)磺胺類藥物對(duì)雞球蟲病有療效以來，國(guó)內(nèi)外已有50余種藥物用于防治球蟲病，大致分為離子載體類抗球蟲藥和化學(xué)合成類抗球蟲藥。本試驗(yàn)選用的8種常用的抗球蟲藥，其中鹽霉素、拉沙洛西、馬杜米星屬于離子載體類抗生素，地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、尼卡巴嗪、癸氧喹酯均屬于化學(xué)合成藥。離子載體類抗生素具有相似的抗球蟲作用機(jī)制，都能與細(xì)胞外的陽(yáng)性離子（尤其K+、Na+、Ca2+和Mg2+）結(jié)合成脂溶性絡(luò)合物，通過細(xì)胞膜上的“膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白”不斷將陽(yáng)離子送入細(xì)胞內(nèi)，破壞球蟲離子平衡，最終殺死或者抑制球蟲[11]?；瘜W(xué)合成抗球蟲藥物種類繁多且作用機(jī)制不盡相同，其中氯苯胍可干擾蛋白質(zhì)的形成，癸氧喹酯可破壞球蟲線粒體內(nèi)細(xì)胞色素的傳遞，而地克株利、二硝托胺和尼卡巴嗪的作用機(jī)制至今還不清楚[12,13]。

本試驗(yàn)中，用地克珠利預(yù)防巨型艾美耳球蟲早熟株感染雞的增重較差（POAA為陽(yáng)性），而預(yù)防柔嫩艾美耳球蟲早熟株感染雞的增重效果良好，原因可能是該藥對(duì)不同球蟲主要作用峰期有異，而影響雞的生長(zhǎng)發(fā)育。據(jù)報(bào)道，地克珠利對(duì)柔嫩艾美耳球蟲無性生殖和有性生殖階段都有作用，對(duì)巨型艾美耳球蟲主要作用在合子階段，對(duì)裂殖生殖階段無效，而裂殖生殖是球蟲對(duì)宿主損失最嚴(yán)重的階段[14]。揚(yáng)州市、安徽省等地野外球蟲分離株均對(duì)二硝托胺產(chǎn)生完全耐藥性[15-17]，而本試驗(yàn)中所用的巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲兩個(gè)早熟株均由實(shí)驗(yàn)室早期分離保存的母株誘導(dǎo)而來，對(duì)二硝托胺產(chǎn)生耐藥性的可能性不大。二硝托胺對(duì)兩個(gè)早熟株感染組的減卵率達(dá)94%以上，效果極為顯著，但增重偏差，可能是二硝托胺對(duì)雞的生長(zhǎng)有一定影響所致。鹽霉素是一種對(duì)球蟲很有效的藥物，在人工感染柔嫩艾美耳球蟲孢子化卵囊8萬(wàn)/羽的籠飼試驗(yàn)中，鹽霉素防治組的相對(duì)增重率達(dá)88.82%～94.24%[18,19]。在本試驗(yàn)中，鹽霉素對(duì)巨型艾美耳球蟲和柔嫩艾美耳球蟲兩個(gè)早熟株感染組，在控制腸道病變和卵囊產(chǎn)量方面均效果顯著，但在增重方面卻效果不明顯，其相對(duì)增重率僅為64.83%和51.06%，導(dǎo)致POAA為陽(yáng)性。造成增重較差的原因可能是鹽霉素發(fā)生降解，降解產(chǎn)物影響了雞的生長(zhǎng)發(fā)育[20]。

本文采用POAA、RLS、ROP和ACI 4項(xiàng)指標(biāo)，綜合檢測(cè)了巨型艾美耳球蟲早熟株和柔嫩艾美耳球蟲早熟株對(duì)8種常用抗球蟲藥物的敏感性。結(jié)果顯示，兩個(gè)早熟株對(duì)地克珠利、氯苯胍、二硝托胺、癸氧喹酯、尼卡巴嗪、馬杜米星、拉沙洛西均敏感，而對(duì)鹽霉素因增重偏低導(dǎo)致敏感性降低，并分析了二硝托胺、鹽霉素引起兩個(gè)早熟蟲株和地克珠利引起巨型艾美耳球蟲早熟株感染組增重偏低的原因。研究結(jié)果為開發(fā)和應(yīng)用球蟲早熟株疫苗積累了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

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