鴿圓環(huán)病毒福建株全基因組序列分析

萬(wàn)春和，黃 瑜，程龍飛, 傅光華, 施少華, 陳紅梅

（福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所，福州 350013)

圓環(huán)病毒科（Circoviridae）包括2個(gè)屬：圓圈病毒屬（Gyrovirus）和圓環(huán)病毒屬（Circovirus）。圓圈病毒屬只有雞貧血病毒（Chicken infectious anemia virus, CIAV）一個(gè)成員；而圓環(huán)病毒屬目前有包括豬圓環(huán)病毒（Porcine circoviruses, PCV1 、PCV2）I型和II 型、鸚鵡喙羽病毒（Psittacine beak and feather disease virus, BFDV）[1]、鴿圓環(huán)病毒（Pigeon circovirus, PiCV）[2]、鵝圓環(huán)病毒（Goose circovirus,GoCV）[3]、鴨圓環(huán)病毒（Duck circovirus, DuCV）[4]、金絲雀圓環(huán)病毒(Canary circovirus,CaCV)[5]、渡鴉圓環(huán)病毒(Raven circovirus, RaCV)[6]、八哥圓環(huán)病毒（Starling circovirus，StCV）[7]、雀圓環(huán)病毒(Finch circovirus, FiCV)、鷗圓環(huán)病毒(Gull circovirus,GuCV)[8]和天鵝圓環(huán)病毒(Mute swans (Cygnus olor)circovirus, SwCV)[9]等。

鴿圓環(huán)病毒(GoCV)最早于1993年在美國(guó)報(bào)道[10]，此后在加拿大[11]、澳大利亞[12]、德國(guó)[2]、英國(guó)[3]、法國(guó)[13]、比利時(shí)[14]、意大利[15]和美國(guó)[16]均發(fā)現(xiàn)有感染報(bào)道。余旭平等[17,18]最早在中國(guó)浙江省檢測(cè)到鴿圓環(huán)病毒感染，并對(duì)浙江省鴿圓環(huán)病毒的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析。本文根據(jù)GenBank登錄已發(fā)表的PiCV序列設(shè)計(jì)引物，對(duì)來(lái)自福建省某信鴿養(yǎng)殖廠送檢病料進(jìn)行PiCV檢測(cè)，通過(guò)反向PCR技術(shù)獲得全長(zhǎng)基因序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。

1 材料與方法

1.1 主要試劑蛋白酶K（Proteinase K）和十二烷基硫酸鈉（SDS） 購(gòu)自Sigma公司；DreamTaq Green PCR Master Mix購(gòu)自Fermentas公司；DNA Marker（DL2000）和pMD18-T載體均購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；膠回收試劑盒、質(zhì)粒純化試劑盒均購(gòu)自O(shè)mega；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞自制。

1.2 病料處理及核酸提取參考文獻(xiàn)[19]，實(shí)驗(yàn)病料為來(lái)自福建省某信鴿場(chǎng)，采集送檢信鴿肝臟和脾臟。將組織以無(wú)菌PBS（pH 7.4）1: 5按常規(guī)方法勻漿后，反復(fù)凍融3次。提取鴿圓環(huán)病毒基因組DNA步驟：取1 mL組織勻漿液于室溫10 000×g離心5 min，取540μL上清，加入60μL 10% SDS于37℃水浴作用30 min，加入15μL蛋白酶K（20 mg/mL），混勻后于56℃水浴作用2 h，間或搖勻。取出后分別置于95℃ 和-20℃各5 min后，加入等體積Tris飽和酚，混勻后靜置15 min后，4℃ 12 000×g離心10 min。取離心上清再次加入等體積Tris飽和酚，重復(fù)離心。取離心上清加入1/10（上清體積）pH 5.2 醋酸鈉溶液和1/10（上清體積）異丙醇，混勻后置于-20℃過(guò)夜后，4℃ 12 000×g離心10 min，棄上清，揮發(fā)片刻后加入30 μL滅菌去離子水重懸，-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 鴿圓環(huán)病毒基因的PCR擴(kuò)增參考文獻(xiàn)[16]設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增的目的片段大小約為759 nt。引物序列 為 P1F：5'-GATGACTTCTACGGCTGGCTGCC-3'、P1R: 5'-ACGGCAAACCAGTCGGCAGCAACC-3'。PCR采用50μL體系：DreamTaq Green PCR Master Mix 25μL、上下游引物（引物濃度為20 mmol/L）各 1μL、DNA 模板 1μL、加雙蒸水至終體積為50μL。反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行94 ℃變性50 s、53 ℃退火35 s、72℃延伸1 min循環(huán)，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。將PCR產(chǎn)物目的片段經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用雙酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，隨機(jī)選取3個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒送由上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.4 病毒全基因組的測(cè)定根據(jù)1.3中的測(cè)序結(jié)果，參考GenBank中鴿圓環(huán)病毒登錄的序列設(shè)計(jì)一對(duì)反向引物（invers-primer）用于擴(kuò)增病毒基因組余下的基因片段P2F：5'-TCACTTCACATTCATAATACAT-3'、P2R: 5'-TGCTGGTCACTATTATCACGC-3'。擴(kuò)增片段大小約1560 nt，引物由上海生工生物工程有限公司合成。反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，隨后進(jìn)行94℃變性 50 s、52℃退火35 s、72℃延伸 100 s，35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束后，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增效果。將PCR產(chǎn)物目的片段經(jīng)膠回收試劑盒純化后與pMD18-T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，用雙酶切和PCR方法鑒定重組質(zhì)粒，隨機(jī)選取3個(gè)陽(yáng)性重組質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行序列測(cè)定。

1.5 全基因序列分析將測(cè)序結(jié)果與GenBank中登錄的序列進(jìn)行分析，用Lasergene v 7.1 DNAStar軟件進(jìn)行序列整理和校對(duì)，將拼接后的核苷酸序列，分別與GenBank中登錄的鴿圓環(huán)病毒（GenBank登錄號(hào)見(jiàn)表1）進(jìn)行同源性比較，用MEGA4.1繪制遺傳進(jìn)化樹[20]，以鵝圓環(huán)病毒株（GenBank登錄號(hào)GU320569）作為外支（outgroup），用Bootstrap對(duì)進(jìn)化樹的可靠性進(jìn)行評(píng)價(jià)，重復(fù)1000次。

2 結(jié)果

2.1 測(cè)序結(jié)果應(yīng)用Lasergene v 7.1 DNAStar軟件分析序列測(cè)定結(jié)果，并進(jìn)行序列拼接后獲得PiCV-fj1株病毒基因組全長(zhǎng)2037 nt（GenBank登錄號(hào)JN183455）。分析可得，該株病毒ORF-V1(41～994nt) 編碼復(fù)制相關(guān)結(jié)構(gòu)蛋白（the replicated-associated protein，Rep），ORF-C1（1987～1166nt）編碼核衣殼蛋白（the putative capsid protein，Cap）。在2個(gè)主要編碼區(qū)外，還存在有2個(gè)可能與病毒復(fù)制有關(guān)的基因間區(qū)（intergenic region）：其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′斷之間的區(qū)域，由2個(gè)反向的重復(fù)序列構(gòu)成了一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)(見(jiàn)圖1)，其頂部有1個(gè)保守的9堿基序列“TAGTATT①AC”（①position 1）。其在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的下游還存在有反向重復(fù)序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG)，N表示堿基不完全互補(bǔ)；其3′端基因間區(qū)長(zhǎng)度為171nt。

圖1 鴿圓環(huán)病毒福建株5′基因間區(qū)結(jié)構(gòu)圖Fig.1 The 5'intergenic region of Pigeon circovirus fj1 strain

2.3 核苷酸同源性比較應(yīng)用Lasergene v7.1DNAStar軟件（By Clustal W Method Sequence Distance），將拼接后核苷酸序列，與GenBank登錄的所有的鴿圓環(huán)病毒全基因序列進(jìn)行同源性比較，結(jié)果見(jiàn)表1。與比利時(shí)分離株Bel936同源性最高，達(dá)93.8%；與澳大利亞分離株Dove同源性最低，僅84.5%。

2.4 遺傳進(jìn)化分析以GoCV作為外支，運(yùn)用MEGA4.1繪制鴿圓環(huán)病毒福建株fj1和GenBank登錄的所有鴿圓環(huán)病毒遺傳進(jìn)化樹，并用Bootstrap評(píng)價(jià)進(jìn)化樹的可靠性，重復(fù)1000次，結(jié)果見(jiàn)圖2?？梢?jiàn)，鴿圓環(huán)病毒在遺傳進(jìn)化上分為2個(gè)明顯的分支，以編碼核衣殼蛋白（ORF-C1，Cap蛋白）起始密碼子“ATA”和“ATG”的差異（見(jiàn)表1）分為ATA分支和ATG分支（fj1§為鴿圓環(huán)病毒福建株）。

3 討論

3.1 到目前為止，圓環(huán)病毒屬除PCV（PCV1和PCV2）可以在PK-15細(xì)胞中繁殖外，其余成員均尚未能細(xì)胞培養(yǎng)，大大限制了對(duì)其進(jìn)行深入研究。圓環(huán)病毒為無(wú)囊膜、二十面體對(duì)稱的動(dòng)物病毒，其復(fù)制需要依賴于旺盛的宿主細(xì)胞活力，增殖速度快的淋巴細(xì)胞是圓環(huán)病毒侵染的主要宿主。因此，圓環(huán)病毒感染往往導(dǎo)致機(jī)體免疫混亂、免疫力下降，進(jìn)而引起多種條件性病原的二次感染，鴿感染圓環(huán)病毒后可表現(xiàn)為昏睡、食欲降低、體重減輕等癥狀[10-16,18,21]。本研究中福建某地送檢的信鴿?rùn)z測(cè)到PiCV感染，由于PiCV既可通過(guò)糞便等污染物水平傳播，又可經(jīng)鴿胚垂直傳播[22]，提示我們?cè)谛砒澮N環(huán)節(jié)應(yīng)注意相關(guān)感染的監(jiān)測(cè)。

3.2 本實(shí)驗(yàn)株fj1基因組全長(zhǎng)為2037 nt，與比利時(shí)分離株Bel936同源性最高，達(dá)93.8%；與澳大利亞分離株Dove同源性最低，僅84.5%，和余旭平報(bào)道的稍有差異。經(jīng)分析fj1基因組編碼2個(gè)主要ORF(見(jiàn)表1)：復(fù)制相關(guān)rep蛋白編碼的ORFV1(41～994nt)， 外 殼 蛋 白 cap 編 碼 的 ORF-C1(1987～1166 nt)。在病毒的兩個(gè)主要編碼區(qū)外還存在有2個(gè)可能與病毒復(fù)制、增殖相關(guān)的基因間區(qū)：其中位于ORF-C1和ORF-V1的5′端之間的區(qū)域，fj1株長(zhǎng)度為90 nt，其他鴿圓環(huán)病毒5′端間區(qū)長(zhǎng)短略有差異，主要集中在90～101 nt之間（數(shù)據(jù)未給出），由2個(gè)反向的重復(fù)序列構(gòu)成了一個(gè)發(fā)夾結(jié)構(gòu)，

其頂部有1個(gè)保守的9堿基序列“TAGTATT①AC”（①position 1）。其在莖環(huán)結(jié)構(gòu)的下游還存在有反向重復(fù)序列(CACGGAGCCACNATCGC和GCGATNGTGGCTCCGTG) ,一般認(rèn)為該病毒是通過(guò)滾環(huán)模式進(jìn)行核酸復(fù)制，反向PCR擴(kuò)增剩余病毒基因組片段也正是基于上述特點(diǎn)。其ORF-C1編碼的Cap蛋白起始密碼子有2類，除常見(jiàn)的“ATG”外還有“ATA”，這和其3′端基因間區(qū)長(zhǎng)度為171 nt或170 nt有關(guān)：3′端基因間區(qū)長(zhǎng)度為171nt，其ORF-C1起始密碼子均為“ATG”，而3′端基因間區(qū)長(zhǎng)度為170 nt，其ORF-C1起始密碼子均為ATA（見(jiàn)表1）。

表1 fj1株與其它鴿圓環(huán)病毒全基因核苷酸同源性分析Table1 Homology identity analysis all of the nucleotide in the genus Pigeon circovirus

圖2 鴿圓環(huán)病毒遺傳進(jìn)化分析Fig.2 Phylogenetic analysis of Pigeon circoviruses

3.3 對(duì)GenBank中登錄的所有鴿圓環(huán)病毒全基因序列進(jìn)行遺傳進(jìn)化分析（圖2），可見(jiàn)鴿圓環(huán)病毒在遺傳進(jìn)化上分為兩個(gè)明顯的分支。結(jié)果分析表明，兩個(gè)獨(dú)立遺傳進(jìn)化分支與編碼核衣殼蛋白（ORF-C1，Cap蛋白）起始密碼子堿基（ATA和ATG）（見(jiàn)表1）相一致，其中Cap蛋白起始密碼子為“ATA”為一個(gè)分支，而Cap蛋白起始密碼子為“ATG”均處在另外一個(gè)分支。本實(shí)驗(yàn)株和我國(guó)浙江分離株均處在“ATG”分支，但分處不同的亞群，提示我國(guó)PiCV的感染和進(jìn)化可能有不同的進(jìn)化來(lái)源或獨(dú)立進(jìn)化的時(shí)間較長(zhǎng)，相關(guān)遺傳進(jìn)化與編碼Cap蛋白起始密碼子的關(guān)聯(lián)還需要更多更深入的研究。

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