正鏈RNA病毒復(fù)制酶結(jié)構(gòu)與功能研究進展

王 超 ，吳 潤，劉光清

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所，上海 200241；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，蘭州 730070）

正鏈RNA病毒是一類基因組為單股正鏈RNA分子的病毒，約占病毒總分類的1/3以上，種類數(shù)目非常龐大，例如常見的小RNA病毒科（Piconaviridae）、嵌杯病毒科（Caliciviridae）、星狀病毒科（Astroviridae）、野田村病毒科（Nodaviridae）、黃病毒科（Flaviviridae）、披膜病毒科（Togaviridae）以及一些重要的植物病毒等，感染宿主譜非常廣泛。除逆轉(zhuǎn)錄病毒外，所有正鏈RNA病毒都編碼有RNA依賴性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase, RdRp）[1]，它與病毒編碼的一些蛋白酶（如解旋酶）以及宿主細胞因子一起構(gòu)成病毒的復(fù)制酶系統(tǒng)[2,3]，負責(zé)病毒基因組的復(fù)制。其中，RdRp是復(fù)制酶系統(tǒng)中的核心成分。因此，研究RdRp的結(jié)構(gòu)與功能對于闡明正鏈RNA病毒的復(fù)制和調(diào)控機理等具有重要意義。近年來，關(guān)于RdRp的結(jié)構(gòu)與功能研究已取得了許多令人矚目的進展，本文即對相關(guān)研究進展進行綜述。

1 RdRp概述

根據(jù)RdRp氨基酸序列的相似性和種系發(fā)生分析，大致可以將其劃分為三個大的超群（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）。其中Ⅰ群的代表病毒有小RNA病毒、野田村病毒、豇豆花葉病毒、線蟲多面體病毒等；Ⅱ群的代表病毒有香石竹斑駁病毒、瘟病毒、丙型肝炎病毒、單鏈RNA噬菌體等；Ⅲ群的代表病毒有煙草花葉病毒、甲病毒、風(fēng)疹病毒、戊型肝炎病毒等[1]。三個超群的RdRp都纏繞折疊形成一個準確的包圍著八個保守基序（Ⅰ-Ⅷ）的結(jié)構(gòu)，其中四個基序存在于各類的聚合酶中，包括DNA依賴的RNA聚合酶（DdRp）、DNA依賴的DNA聚合酶（DdDp）和RNA依賴的DNA聚合酶（RdDp）[4-5]。在這八個保守基序中，只有五個氨基酸殘基是所有聚合酶中完全保守的，它們分別是基序Ⅰ中的Lys3、基序Ⅳ中的Asp118和Asp124及基序Ⅵ中的Asp268和Asp269。當然，這三個超群的聚合酶在序列上也是有相互關(guān)系的，雖然有些氨基酸殘基較為保守，比如，一個超群中的一些保守性殘基也存在于其他的超群中。RdRp與病毒蛋白和一些宿主細胞因子一起組成復(fù)制復(fù)合物，共同執(zhí)行復(fù)制酶功能。例如，脊髓灰質(zhì)炎病毒的復(fù)制復(fù)合物包含宿主的Poly(C)和Poly(A)結(jié)合蛋白（分別為PCBP和PABP）、多聚酶前體3CD[6]和EF-1α[7]等。

2 RdRp的氨基酸序列與高級結(jié)構(gòu)

2.1 RdRp的氨基酸序列特征目前，一些重要RNA病毒的RdRp的結(jié)構(gòu)與功能研究已經(jīng)取得重大進展。如脊髓灰質(zhì)炎病毒（Poliovirus，PV）[8]、丙型肝炎病毒（hepatitis C virus，HCV）[9]、兔出血癥病毒（Rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）[10]、口蹄疫病毒（Foot-and-mouth disease virus，F(xiàn)MDV）[11]等的RdRp晶體結(jié)構(gòu)已基本闡明。RdRp結(jié)構(gòu)域的N端殘基包含了部分多肽鏈，在位置和構(gòu)型上與RdRp對應(yīng)的殘基不同，剪切了的N端插入到一個結(jié)合袋中與許多氫鍵結(jié)合。

前文提到的三個超群中，每個超群都有其標志性的保守氨基酸殘基，包括：超群Ⅰ中的Lys/Arg12（基序Ⅰ）、Arg27（基序Ⅱ）、Gly72（基序Ⅲ）、Phe/Tyr339（基序Ⅶ）；超群Ⅱ中的Arg32（基序Ⅱ）、Ser/Thr128（基序Ⅳ）、Cys340（基序Ⅶ）、Arg/Lys365（基序Ⅷ）；超群Ⅲ中的Ser/Thr190、Thr/Ser200（基序Ⅴ）。值得注意的是，這些標志性的氨基酸殘基在各個超群的次要成員中也是保守的。另外，雖然有些病毒的聚合酶的親緣關(guān)系很遠，在一些保守基序中卻表現(xiàn)出很高的相似性。例如，馬鈴薯Y屬病毒和冠狀病毒聚合酶的基序Ⅲ和小RNA病毒聚合酶的基序Ⅶ[1]。

正鏈RNA病毒聚合酶多肽鏈的保守區(qū)域規(guī)則地分布在C-末端附近（除了豇豆花葉病毒組和線蟲傳多面體病毒），小RNA病毒的聚合酶是所有正鏈RNA病毒中最小的，整個多肽鏈中60%都是保守性的區(qū)域，說明這些保守性基序可能包含了RNA延伸中的大部分氨基酸殘基。

2.2 RdRp的高級結(jié)構(gòu)特征脊髓灰質(zhì)炎病毒的RdRp的晶體結(jié)構(gòu)是第一個被確定下來的很典型的聚合酶結(jié)構(gòu)，同其他種類的聚合酶相似，呈右手型，具有三個亞結(jié)構(gòu)域：掌型亞結(jié)構(gòu)域（palm subdomain）、拇指型亞結(jié)構(gòu)域（thumb subdomain）和手指型亞結(jié)構(gòu)域（finger subdomain）（圖1(ii)）[12]。掌型亞結(jié)構(gòu)域中的氨基酸序列呈高度保守性，在PV中，4段核苷酸基序（A-D，圖1(iii)）相互折疊形成了掌型的中心區(qū)域，包括上面的2個α-螺旋和下面的4個反相平行的β-折疊片；C段中高度保守的GDD活性位點存在于所有的RdRp中[1，13]；E段位于掌型亞結(jié)構(gòu)域和拇指型亞結(jié)構(gòu)域中間。拇指型亞結(jié)構(gòu)域大部分是由α-螺旋化的C-氨基酸殘基組成，還包括N-端的一個β-折疊片[14]。手指型亞結(jié)構(gòu)域包括四個不同的緊密的纏繞在一起的氨基酸序列，分別是：“食指”、“中指”、“無名指”、“小指”（圖1(iii)）[15]。拇指型亞結(jié)構(gòu)域和手指型亞結(jié)構(gòu)域之間的相互作用形成了一個完全包圍著GDD活性位點的構(gòu)象，而且，在聚合酶的后面形成了一個NTP的進入通道。PV的RdRp的這種拓撲結(jié)構(gòu)和其他的小RNA病毒的非常相似（圖1(iv)），包括人鼻病毒（Human rhinovirus，HRV）[16]和口蹄疫病毒（FMDV）[11]的RdRp，盡管他們的一級結(jié)構(gòu)有很低的同源性。此外，RdRp還有一個很重要的特點是有很多聚合酶之間相互作用的區(qū)域。

3 RdRp的生物學(xué)功能與作用機制

圖1 脊髓灰質(zhì)炎病毒3Dpol結(jié)構(gòu)

RdRp起始RNA合成的機制主要有兩種：即引物依賴的RNA合成（primer-dependent RNA synthesis）和非引物依賴的RNA合成即從頭合成（De novo RNA sythesis）兩種方式[17]。其中，前者根據(jù)所依賴引物的不同又可分為3種：蛋白引物，如小RNA病毒科的PV等；前導(dǎo)引物，如冠狀病毒科的小鼠肝炎病毒等；模板引物，如嵌杯病毒科的兔出血癥病毒等。后者根據(jù)起始位點的不同又可分為2種：末端起始，基因組不分節(jié)段的正鏈RNA病毒大多采用這種方式，如噬菌體Qβ采用3'末端從頭合成機制起始RNA合成[18]；內(nèi)部起始，基因組分節(jié)段的正鏈RNA病毒大多采用這種方式起始亞基因組RNA的合成，如HCV能通過內(nèi)部從頭合成的方式起始RNA的合成[19]。有些病毒只采用一種方式起始RNA合成，有些則采用兩種或兩種以上的方式。所以，RdRp的生物學(xué)功能與作用機制也有很多種，下面就目前研究的比較透徹的小RNA病毒科的PV來詳細地闡述RdRp的生物學(xué)功能。

在小RNA病毒中，病毒產(chǎn)生的多聚蛋白需要病毒編碼的蛋白酶切割成成熟的蛋白，包括一些前體蛋白，在病毒復(fù)制的多個過程中起到了重要作用，PV的3CDPro是病毒蛋白酶3CPro和3Dpol（RdRp）的前體蛋白，具有多種功能[20]。它具有與3CPro不同的蛋白酶切活性，但卻沒有聚合酶活性[21]。它酶切產(chǎn)生病毒結(jié)構(gòu)蛋白VP0、VP1、VP3和非結(jié)構(gòu)蛋白3AB、3CD、3CPro、3Dpol。RdRp催化尿苷酸（uridine monophosphate，UMP）共價連接到小蛋白VPg的酪氨酸的N-端上，這個尿嘧啶化的VPg之后就作為RNA合成起始的蛋白引物[22，23]。這個過程也被稱為VPg的尿苷酰化作用。正鏈的合成被認為是利用PV基因組上的一個RNA發(fā)夾結(jié)構(gòu)作為其引物[24，25]。一種模型（圖2）[26]認為在PV基因組上的2C非編碼區(qū)上的順式作用復(fù)制信號cre(2C)結(jié)合3CD與結(jié)合了VPg的3Dpol形成一個多組分的復(fù)合物[24]。尿嘧啶化的VPg接著轉(zhuǎn)移到病毒RNA的3'端，通過聚合酶開始合成VPg連接的RNA。在負鏈合成中，Poly(A)可能作為尿嘧啶化的引物，雖然Poly(A)模板沒有特異性也不需要3CD來幫助VPg的尿嘧啶化[27]。小RNA病毒復(fù)制起始于兩個UMP連續(xù)地共價連接到引物蛋白VPg的Tyr3的羥基上（VPg-pUpU），由3DPol利用一個內(nèi)部基因組莖環(huán)cre作為模板采用一個回滑機制發(fā)揮催化功能（圖3）[28]。

以保守的A1A2ACA序列莖環(huán)中的A1作為模板，由3Dpol來催化UMP和VPg-Tyr的羥基之間形成磷酸二酯鍵。然后，VPg-pU回滑至A2并與A2形成氫鍵，之后第二個UMP就添加到了A1模板上，最后，就形成了VPg-pUpU。

圖2 3CD參與的VPg尿嘧啶化模型

圖3 PV 3Dpol催化形成VPg-pUpU回滑機制模型

4 RdRp的研究意義

4.1 有助于研發(fā)抗病毒藥物正鏈RNA病毒不僅對人類的健康構(gòu)成了威脅而且嚴重危害著經(jīng)濟動植物的生長，為了有效的預(yù)防和抵抗這類病毒的侵襲，就必須深入了解病毒的整個生命周期，掌握病毒RNA基因組的復(fù)制過程， 明確RdRp在整個復(fù)制過程中的作用機制。在此基礎(chǔ)上，可以考慮將RdRp作為抗病毒治療的靶標，研究抗病毒藥物，在基因組復(fù)制環(huán)節(jié)，阻斷病毒的生命過程。近年來，RNA沉默技術(shù)為研發(fā)抗RNA病毒的藥物提供了一個嶄新的途徑，因此，可以根據(jù)RdRp的基因序列，利用RNA干擾方法，減弱或阻斷病毒的復(fù)制過程，進而達到抗病毒治療的目的。例如，Ashfaq等[29]研究認為針對于非結(jié)構(gòu)蛋白NS2-NS5B（RdRp）的siRNAs可以有效地阻止HCV在Huh-7細胞內(nèi)的復(fù)制。NS4Bsi-166和NS5Bsi-1064可以引起HCV RNA基因組明顯的減少，并且在20μmol/L濃度時可以抑制病毒滴度達90%以上。 RNA沉默藥物將有望成為一種更為高效快捷的抗病毒治療途徑。

4.2 有助于研發(fā)疫苗同其他的RNA病毒一樣，RdRp的復(fù)制缺乏校準機制，其錯配率一般在10-3～10-4之間。正是因為這個原因，RNA病毒種群是以準種的形式存在的[30]。由于準種多樣性的原因，RNA病毒在面對選擇壓力時可以很快的適應(yīng)，例如暴露在宿主的免疫防御機制下的時候[31]。RNA病毒準種的多樣性使得RNA病毒的種群的量已經(jīng)接近“誤差災(zāi)變論”的閾值，因此，適當增加錯配率的話就會導(dǎo)致大部分病毒基因組失去活性以及病毒種群的滅亡。比如核苷酸類似物病毒唑的突變則增加了PV基因組的核酸錯配率，就會導(dǎo)致病毒種群的滅亡[32]，所以，PV對于病毒唑的抵抗依賴于RdRp中的一個氨基酸位點的突變即：Gly64→Ser（G64S）[33]。有趣的是，這個突變增加了RdRp復(fù)制的保真性，所以，在病毒復(fù)制的時候錯配率就相應(yīng)的減少了。RNA病毒種群的生存依賴于其復(fù)制的錯誤性和基因組靈活性之間的一種平衡。復(fù)制錯配率太高會導(dǎo)致種群的滅亡，過低則會因不能適應(yīng)宿主的環(huán)境而滅亡。所以，RdRp復(fù)制的保真性則使得臨床診斷的意義更加重大[12]。

病毒復(fù)制的錯誤性直接決定了病毒種群躲避免疫中和作用和抵抗抗病毒藥物的能力，相應(yīng)的，RdRp保真性微小的增加都會使病毒的毒力減弱。據(jù)此，可以考慮研制RNA病毒的減毒疫苗。RdRp還與病毒的感染相關(guān)，最初將其稱為病毒感染相關(guān)抗原，有研究表明該蛋白可能含有一些特異性的抗原位點，通過對其潛在B細胞表位的預(yù)測、分析和研究，進一步研發(fā)抗病毒的多表位疫苗也是一條良好的思路[34]。

4.3 有助于研究RNA病毒的分子演化對于正鏈RNA病毒RdRp結(jié)構(gòu)和功能的研究也許和分子演化的過程也是密切相關(guān)的。地球上早期的生命形式很可能是由RNAs占據(jù)著主導(dǎo)地位，它不僅是遺傳物質(zhì)而且也是催化單位[35，36]。RNA是很多細胞生命過程中重要的組成部分，在翻譯、核酸剪接和DNA復(fù)制等過程中都發(fā)揮了重要的作用，RNA的這種廣泛的存在性是和它在生命進化過程中的原始功能是一致的。DNA和蛋白質(zhì)是在隨后的細胞生命過程中出現(xiàn)的，病毒復(fù)制酶很有可能是首批出現(xiàn)的蛋白質(zhì)中的一員，具有特異性識別DNA的能力。RdRp在RNA合成過程中的一些高度有序的作用步驟和DdRps是相一致的[37，38]。Siegel等[39]研究認為雀麥草花葉病毒（Brome mosaic virus，BMV）的RdRp可以精確地以單股DNA為模板起始RNA的合成，而且，模板競爭實驗結(jié)果顯示，RdRp在與RNA和DNA的相互作用過程中具有相似的親和力。這些結(jié)果表明了RdRp可以很容易地參與到DNA的轉(zhuǎn)錄過程中。因此，研究不同種RNA病毒復(fù)制酶基因之間的親緣關(guān)系，對于揭示病毒之間的遺傳和進化關(guān)系具有重要意義，對于一些新發(fā)現(xiàn)的RNA病毒，可以根據(jù)其復(fù)制酶基因的編碼序列，判定它在RNA病毒家族中的地位，也可以據(jù)此探討其來源及演化規(guī)律。

5 結(jié)語

研究RNA病毒的復(fù)制過程與機理對于闡述該類病毒的生命周期與規(guī)律，甚至研發(fā)抗病毒藥物或疫苗等都具有重要意義。而RdRp則是催化RNA病毒復(fù)制的關(guān)鍵蛋白酶，闡明了RdRp的生物學(xué)特性、結(jié)構(gòu)與功能以及發(fā)揮催化功能的機制等，也就拿到了研究RNA病毒生命規(guī)律的鑰匙。近年來，隨著生物信息學(xué)及多種生命科學(xué)研究技術(shù)的不斷發(fā)展，一些重要RNA病毒的復(fù)制酶結(jié)構(gòu)和功能陸續(xù)得到了比較透徹的研究，其研究成果也被逐漸應(yīng)用于RNA病毒的基礎(chǔ)和應(yīng)用研究之中?？梢韵嘈牛S著對RdRp結(jié)構(gòu)與功能的不斷深入探索和研究，我們對單股正鏈RNA病毒的生命規(guī)律將會有更清晰的了解和認識、這對于研發(fā)新型和有效的抗病毒藥物和疫苗等將具有重要的理論和指導(dǎo)價值。

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