二甲雙胍對骨向分化骨髓基質(zhì)細(xì)胞增殖和分化的影響

張海波 梁偉之 高 鶯 胡 靜

二甲雙胍是一種對抗2型糖尿病的常用藥物，通過降低肝臟產(chǎn)生葡萄糖，增加外周組織對胰島素的敏感性，從而實(shí)現(xiàn)葡萄糖的利用，其臨床藥效已受到充分肯定［1］。2型糖尿病人往往伴發(fā)骨密度減低，已經(jīng)有學(xué)者開始研究二甲雙胍對骨代謝的影響，但目前相關(guān)報道還較少［2～4］。因此，本實(shí)驗(yàn)旨在原代培養(yǎng)大鼠骨髓基質(zhì)細(xì)胞(bone marrow stromal cells，BMSCs)的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行骨向誘導(dǎo)分化，觀察二甲雙胍對細(xì)胞增殖和分化的影響，并從轉(zhuǎn)錄因子水平探討其機(jī)制，為深入研究雙胍類藥物的成骨作用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1.材料:α－MEM培養(yǎng)基、胰酶、胎牛血清購自Gibco公司;二甲雙胍購自Calbiochem公司;地塞米松、β－甘油磷酸鈉、維生素C、維生素D3及茜素紅均購自Sigma公司。

2.方法:(1)大鼠BMSCs的原代分離培養(yǎng)及骨向誘導(dǎo)分化:選用鼠齡匹配、體重200～250g的SD雌性大鼠(四川大學(xué)華西醫(yī)學(xué)中心實(shí)驗(yàn)動物部提供)，無菌條件下將其脛骨和股骨的骨髓用注射器沖出，在含有10%胎牛血清及100μl/ml雙抗的α－MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中貼壁培養(yǎng)。細(xì)胞生長融合達(dá)到80%時，用胰酶消化，進(jìn)行1∶2傳代，傳代細(xì)胞的培養(yǎng)基為骨向誘發(fā)分化培養(yǎng)基，即α－MEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基中添加10－8mol/L地塞米松、10mmol/L β－甘油磷酸鈉、50mg/L維生素C和10mmol/L維生素D3。依照是否添加100μmol/L二甲雙胍將細(xì)胞分為用藥組和非用藥組，每2～3天換液［4］。(2)四甲基偶氮唑鹽法(MTT)檢測細(xì)胞增殖:細(xì)胞骨向分化培養(yǎng)24h后，將培養(yǎng)基倒掉，加入MTT溶液，在37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育4h后，吸棄上清，添加二甲亞砜溶解結(jié)晶物，然后在570nm波長下檢測不同組別細(xì)胞的光吸收值(optical density，OD)。MTT檢測每24h進(jìn)行1次，共持續(xù)10天，記錄結(jié)果并繪制生長曲線。(3)堿性磷酸酶(ALP)活性檢測:細(xì)胞骨向分化培養(yǎng)第5天、10天、15天檢測不同組別細(xì)胞的ALP活性。具體操作包括:將細(xì)胞用PBS洗滌，胰酶消化，先后加入培養(yǎng)基、PBS，經(jīng)過多次混勻、離心、棄上清，最后收集細(xì)胞。將細(xì)胞反復(fù)凍融3次后，在酶標(biāo)儀上檢測其405nm波長下OD值，結(jié)果表示為每毫克凍融蛋白所含的ALP，記作U/mg。(4)茜素紅染色及其定量檢測:茜素紅染色在成骨向分化第21天進(jìn)行，用于檢測細(xì)胞外基質(zhì)中的礦化結(jié)節(jié)。將兩組細(xì)胞用PBS洗滌，在70%乙醇－20℃固定1h，再用蒸餾水沖洗，茜素紅染色液中放置10min，經(jīng)過蒸餾水和PBS再次洗滌，用10%氯化十六烷基吡啶脫色30min，最后在540nm波長下檢測兩組細(xì)胞OD值。(5)實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測:骨向分化第21天時，收集用藥組、非用藥組細(xì)胞，提取其RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA，在FTC2000實(shí)時熒光定量基因擴(kuò)增儀上進(jìn)行體外擴(kuò)增。反應(yīng)體系包括:1μl cDNA 樣本、0.36μl dNTP、1μl引物、1μl 1×SYBR Green。擴(kuò)增條件為:①94℃ 2min;② 94℃ 20s、53℃30s、60℃ 40s。45個循環(huán)結(jié)束后，將每個循環(huán)測得的熒光值連接起來得到RT－PCR擴(kuò)增曲線，并確定每個反應(yīng)管內(nèi)熒光信號達(dá)到閾值時經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)(Ct值)。結(jié)果記作:2－ΔCt，ΔCt值=目的基因Ct值－管家基因Ct值。待測成骨特異性基因包括:Cbfa1/Runx2，COL－ I，Lrp5，管家基因是:GAPDH。Cbfa1的引物上游:5'－GGACGAGGCAAGAGTTTCA－3'，下游:5'－CTGTCTGTGCCTTCTTGGTT－3'，長 123bp;COL－ I的引物上游:5'－ATCAAGGTCTACTGCAACAT－3'，下游:5'－CAGGATCGGAACCTTCGCTT－3'，長178bp;Lrp5的引物上游:5'－CCGCCAGCAGCAGATGAT －3'，下游:5'－GGATGGGCTGAGAACTCCT－3'，長135bp;GAPDH 的引物上游:5'－CCTCAAGATTGTCAGCAAT－3'，下游:5'－CCATCCACAGTCTTCTGAGT－3'，長141bp。引物由上海生物工程有限公司合成。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析:采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果表示為均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差。Mann－Whitney U檢驗(yàn)用于組間比較，P＜0.05設(shè)定為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.二甲雙胍對骨向分化BMSCs增殖的影響:原代BMSCs呈均勻分散生長，細(xì)胞多為圓形，胞體較小，隨接種時間延長數(shù)量逐漸增加，體積逐漸增大，形態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮?、不?guī)則形;傳代BMSCs在骨向誘導(dǎo)因子的作用下，增殖活力增強(qiáng)，形成統(tǒng)一的長梭形細(xì)胞，并呈集落樣生長，有一定極性。對傳代的骨向分化細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測，結(jié)果顯示:在10天的檢測期內(nèi)，兩組細(xì)胞的OD值均呈逐漸增高的趨勢，用藥組和非用藥組細(xì)胞相比，其OD值持續(xù)處于較高水平(P＜0.05)，證明二甲雙胍具有顯著的促增殖作用(圖1)。

圖1 用藥組(上)與非用藥組(下)細(xì)胞MTT生長曲線

2.二甲雙胍對骨向分化BMSCs分化的影響:細(xì)胞骨向分化培養(yǎng)第5天檢測ALP活性，用藥組細(xì)胞和非用藥組細(xì)胞相比未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;第10天、15天時，二甲雙胍組細(xì)胞 ALP活性分別為0.553±0.015、0.628 ±0.032，顯著高于非用藥組(P ＜0.05，表1)，初步證實(shí)二甲雙胍的促成骨作用。對骨向分化第21天細(xì)胞進(jìn)行茜素紅染色(圖2)，發(fā)現(xiàn)兩組細(xì)胞均呈明顯的簇狀生長，在生長中心出現(xiàn)大小不一、紅染的礦化結(jié)節(jié);茜素紅洗脫液OD值顯示:用藥組細(xì)胞(0.308±0.011)明顯高于非用藥組細(xì)胞(0.214 ±0.009)(P ＜0.05)，進(jìn)一步證明100mol/L 二甲雙胍顯著促進(jìn)BMSCs成骨向分化。在骨向分化第21天通過RT－PCR定量分析3種成骨特異性基因的mRNA表達(dá)水平:用藥組Cbfa1是對照組3.45倍，COL－Ⅰ是對照組2.28倍，Lrp5是對照組1.41倍，二甲雙胍顯著增加成骨特異性基因表達(dá)(P＜0.05)，可能是該藥物促進(jìn)BMSCs骨向分化的潛在機(jī)制(圖3)。

表1 用藥組、非用藥組細(xì)胞第5、10、15天ALP活性(U/mg)

圖2 礦化結(jié)節(jié)(左)和礦化結(jié)節(jié)茜素紅染色后(右)相差顯微鏡下照片

圖3 RT－PCR定量檢測非用藥組(左)和用藥組(右)細(xì)胞成骨特異性基因Cbfa1、COL－Ⅰ和Lrp5 mRNA表達(dá)量柱狀圖

討 論

糖尿病是中老年人群的常見病、多發(fā)病，患者往往伴有骨質(zhì)疏松等其他系統(tǒng)性疾病，因此有必要探討常用抗糖尿病藥物對骨組織的影響。Vestergaard等進(jìn)行了臨床病例對照研究，結(jié)果表明糖尿病人骨折發(fā)生率明顯高于正常人群，長期服用二甲雙胍可顯著減少糖尿病相關(guān)的骨折發(fā)生率［3］。Cortizo等將二甲雙胍與成骨樣細(xì)胞UMR106和MC3T3E1體外共培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)用藥組細(xì)胞分泌的Ⅰ型膠原產(chǎn)物和堿性磷酸酶較空白組細(xì)胞均明顯增高，提示二甲雙胍對骨代謝可能具有積極作用［4］。

骨髓中的脂肪細(xì)胞與成骨細(xì)胞都是以BMSCs作為前體細(xì)胞，一種細(xì)胞的數(shù)量和活性變動不可避免地會導(dǎo)致另一種細(xì)胞的相應(yīng)變化。既往研究中［5］，我們已經(jīng)證實(shí)二甲雙胍對體外培養(yǎng)的脂向分化BMSCs具有顯著的促進(jìn)增殖、抑制分化作用，雙胍類藥物能通過抑制PPARγ等成脂特異性基因的表達(dá)實(shí)現(xiàn)對BMSCs脂向分化的負(fù)調(diào)控。本實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步在原代培養(yǎng)大鼠BMSCs的基礎(chǔ)上對其進(jìn)行骨向誘導(dǎo)分化，觀察二甲雙胍對細(xì)胞增殖和分化的影響，旨在從干預(yù)BMSCs成骨向分化角度探討二甲雙胍的骨保護(hù)作用。結(jié)果表明，100μmol/L二甲雙胍對骨向分化的BMSCs同樣具有顯著的促增殖作用，并且進(jìn)一步增進(jìn)其骨向分化程度，用藥組細(xì)胞ALP活性與茜素紅脫色液OD值均明顯高于非用藥組，證明一定濃度的二甲雙胍能夠提高成骨細(xì)胞數(shù)量和ALP活性，促進(jìn)礦化結(jié)節(jié)形成。

Cbfa1、COL－Ⅰ和Lrp5都是成骨特異性轉(zhuǎn)錄子，在BMSCs骨向分化過程中起正向調(diào)節(jié)作用，可以提高ALP活性、骨橋蛋白分泌、骨鈣素表達(dá)等。報道指出，敲除Cbfa1基因的顱蓋骨細(xì)胞即使在骨形成蛋白BMP2強(qiáng)烈作用下也不能形成成骨細(xì)胞［6］;而轉(zhuǎn)染Cbfa1基因的骨髓干細(xì)胞骨體內(nèi)外成骨均明顯提高［7］。因此，本研究在骨向分化第21天對兩組細(xì)胞進(jìn)行實(shí)時熒光定量RT－PCR檢測，進(jìn)一步從基因水平對二甲雙胍的促成骨作用加以解釋，發(fā)現(xiàn)二甲雙胍組細(xì)胞成骨特異性轉(zhuǎn)錄子Cbfa1、COL－Ⅰ和Lrp5的mRNA表達(dá)水平較非用藥組而言均呈顯著增高趨勢，尤以Cbfa1為著，提示二甲雙胍在體外試驗(yàn)中促進(jìn)BMSCs骨向分化的機(jī)制之一可能與提高Cbfa1等成骨基因mRNA轉(zhuǎn)錄水平有關(guān)。

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4 Cortizo AM，Sedlinsky C，McCarthy AD，et al.Osteogenic actions of the anti－diabetic drug metformin on osteoblast in culture［J］.Eur J Pharmacol，2006，536(1－2):38－46

5 張海波，張邵軍，高鶯，等.二甲雙胍對脂向分化間充質(zhì)干細(xì)胞的影響［J］.醫(yī)學(xué)研究雜志，2009，38(12):55－57

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