非酒精性脂肪性肝病患者血清細(xì)胞角蛋白18片段水平的變化

蔡文品 吳惠潔 陳 潔

隨著人們生活水平的提高與飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖、高血壓、高血脂、2型糖尿病等發(fā)病率的增加，非酒精性脂肪性肝病(non－alcoholic fatty liver disease，NAFLD)患病率在中國(guó)呈逐年提高且增幅越來(lái)越快的趨勢(shì)，現(xiàn)在NAFLD是除乙型病毒性肝炎外最重要的慢性肝病，對(duì)人們的健康構(gòu)成了嚴(yán)重的威脅。有關(guān)NAFLD的發(fā)病機(jī)制，Day等提出的二次打擊學(xué)說(shuō)已得到公認(rèn)，近年隨著對(duì)細(xì)胞凋亡的深入研究，不斷有證據(jù)表明凋亡在非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展中起重要的作用［1～4］，在凋亡發(fā)生過(guò)程中肝細(xì)胞骨架蛋白之一細(xì)胞角蛋白18被半胱天冬蛋白酶(caspase)分解成不同片段，其中暴露出的含Asp396特異性結(jié)合位點(diǎn)(M30抗原)的細(xì)胞角蛋白18片段水平代表肝細(xì)胞凋亡水平，該片段在外周血中可穩(wěn)定存在。檢測(cè)NAFLD患者血清中凋亡產(chǎn)生的細(xì)胞角蛋白18片段水平的變化在診斷治療中的作用值得探討［5］。

對(duì)象與方法

1.研究對(duì)象:按照2006年2月中華醫(yī)學(xué)會(huì)肝臟醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的非酒精性脂肪性肝病臨床診斷與分型為標(biāo)準(zhǔn)選取2009年4月～2010年2月間來(lái)筆者醫(yī)院進(jìn)行健康體檢者中的NAFLD患者136例。其中非酒精性脂肪性肝炎(NASH)患者47例，男性31例，女性16例，年齡27～62歲(45.6±17.3歲);非酒精性單純性脂肪肝(NAFLD)患者89例，男性59例，女性30例，年齡26～68歲(50.3±19.2歲)。對(duì)照者為經(jīng)B超、實(shí)驗(yàn)室等相關(guān)檢查顯示均正常的健康體檢者，40例，男女性別比例與年齡構(gòu)成與病例組相匹配。所有入選者均需除外急慢性病毒性肝炎、自身免疫性肝炎、色素沉著病、膽管炎患者，近期服用雌激素、甾體類激素、中草藥患者也除外。

2.方法:記錄所有入選者姓名、性別、年齡、身高、體重、既往史、B超檢查結(jié)果，于清晨空腹抽取肘靜脈血6ml，1h內(nèi)分離血清存于－70℃冰箱備用。

常規(guī)生化項(xiàng)目 ALT、AST、γ －GT、GLU、TCH、TG、HDL －C、LDL－C的檢測(cè)，儀器為雅培C8000全自動(dòng)生化儀，試劑為日本和光的;病毒性肝炎檢查(包括甲肝抗體、乙型肝炎兩對(duì)半定性、丙型肝炎抗體、丁型肝炎抗體、戊型肝炎抗體、庚型肝炎抗體)用ELISA法，酶標(biāo)儀為BIO－RAD的model－680，試劑由上?？迫A生物工程股份有限公司提供;自身相關(guān)抗體ANA、ENA的檢測(cè)采用免疫間接熒光法，試劑由歐蒙(杭州)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)診斷有限公司提供，主要儀器為熒光顯微鏡，所有操作嚴(yán)格按儀器的SOP要求進(jìn)行。

細(xì)胞角蛋白18片段水平的檢測(cè)，用ELISA法定量測(cè)定，試劑由CUSABIO生物技術(shù)公司提供的，酶標(biāo)儀讀取吸光度OD值后通過(guò)Curve Expert 1.3軟件來(lái)計(jì)算結(jié)果。

3.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法:用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，所有數(shù)據(jù)以表示，方差分析組間指標(biāo)差異性，Pearson統(tǒng)計(jì)分析CK－18片段水平與其他生化指標(biāo)的相關(guān)性，P＜0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1.各組基本臨床資料信息:見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果、細(xì)胞角蛋白18片段水平的結(jié)果及比較:見(jiàn)表2。

表1 非酒精性脂肪性肝病患者各組基本臨床信息

表2 非酒精性脂肪性肝病患者實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果與分析

2.細(xì)胞角蛋白18片段水平與ALT、AST、γ－GT、TCH、TG的相關(guān)性分析結(jié)果分別為 r=0.473，P＜0.01;r=0.472，P ＜ 0.01;r=0.428，P ＜ 0.01;r=0.017，P ＞0.05;r=0.319，P ＜0.05。

討 論

非酒精性脂肪性肝病是指除外酒精和其他明確的損肝因素所致的，以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變?yōu)橹饕卣鞯呐R床病理綜合征，主要包括非酒精性單純性脂肪肝與非酒精性脂肪性肝炎(NASH)，后者更容易發(fā)展成肝纖維化、肝硬化甚至肝癌，預(yù)后較差，研究表明臨床上已發(fā)展為NASH的患者缺乏明確特異性的體征與癥狀且臨床表現(xiàn)與肝臟病變嚴(yán)重程度無(wú)相關(guān)，因此盡早診斷NAFLD并分型非常重要。目前肝活檢仍然是診斷NAFLD的唯一金標(biāo)準(zhǔn)，但其具有一定的創(chuàng)傷性，此外穿刺技術(shù)、取材部位對(duì)結(jié)果準(zhǔn)確性有一定的影響以及不同短時(shí)間內(nèi)無(wú)法反復(fù)進(jìn)行，不適合臨床常規(guī)應(yīng)用。影像學(xué)診斷NAFLD靈敏度、特異性都不高，且存在較高的漏診率。尋找非創(chuàng)傷性的診斷指標(biāo)顯得非常必要且迫切。

在非酒精性脂肪性肝病發(fā)病機(jī)制研究方面近年來(lái)諸多臨床研究與動(dòng)物試驗(yàn)表明細(xì)胞凋亡在其發(fā)生發(fā)展中扮演重要的角色［6］。CK－18是肝細(xì)胞骨架蛋白之一，在肝細(xì)胞發(fā)生凋亡的過(guò)程中caspase酶分解肝細(xì)胞角蛋白18暴露出特異的Asp396結(jié)合位點(diǎn)的蛋白片段，而肝細(xì)胞壞死不會(huì)產(chǎn)生這種細(xì)胞角蛋白18片段，因此特異地檢測(cè)這種肝細(xì)胞角蛋白18片段水平可較好地反映了肝細(xì)胞凋亡的程度［5］。本研究結(jié)果顯示了非酒精性脂肪性肝病患者血清凋亡產(chǎn)生的CK－18片段水平顯著高于正常對(duì)照者，且NAFLD組內(nèi)NASH患者CK－18片段水平顯著高于NAFLD患者，證實(shí)了肝細(xì)胞凋亡參與了非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展;更為重要的是單純性脂肪肝患者的ALT、AST指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)，與健康對(duì)照者間無(wú)顯著性差別，可單純性脂肪肝患者的血清CK－18片段水平顯著高于健康對(duì)照者，此外NAFLD患者血清凋亡產(chǎn)生的CK－18片段水平與ALT、AST、γ－GT間存在良好的相關(guān)性，r值分別為 0.473、0.472、0.428，表明CK－18片段具有與肝功能相關(guān)指標(biāo)如ALT、AST、γ－GT等同樣的價(jià)值，可用于NAFLD的診斷以及NASH與非酒精性單純性脂肪肝的區(qū)分。

總之凋亡產(chǎn)生的肝細(xì)胞角蛋白18片段一定程度上代表肝臟細(xì)胞凋亡的發(fā)生，深入研究并聯(lián)合應(yīng)用該蛋白片段與非酒精性脂肪性肝病其他諸多發(fā)生機(jī)制如胰島素抵抗、氧化應(yīng)激等相關(guān)細(xì)胞因子、脂肪細(xì)胞因子有望探索出用于NAFLD的新的非創(chuàng)傷性診斷模式。

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4 Mitchell C，Mallet V，Guidotti JE，et al.Experimental modulation of apoptosis:physiopathological and therapeutic targets［J］.J Soc Biol，2005，199:243 －246

5 Alberto Grassi，Micaela Susca，Silvia Ferri，et al.Detection of the M30 neoepitope as a new tool to quantify liver apoptosis［J］.Am J Clin Pathol，2004，121:211－219

6 南月敏，胡云龍，付娜，等.Bad、Bax和Bid蛋白表達(dá)在非酒精性脂肪性肝炎中的作用［J］.世界華人消化雜志，2008，16(1):81－85