海參巖藻聚糖硫酸酯對小鼠急性酒精中毒防治作用的研究

滕來賓，王靜鳳，楊延存，李 冰，張 珣，薛長湖

(中國海洋大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，山東青島 266003)

急性酒精中毒又稱醉酒，指短時(shí)間內(nèi)飲入過量的酒精或酒精飲料后所引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)興奮及隨后的抑制狀態(tài)。在美國，過量飲酒引起的肝臟疾病已成為男性的第4大主要死亡原因［1］。因此，尋找一種有效的解酒護(hù)肝食品或藥品是很有必要的。海參多糖是海參體壁中重要的活性成分，主要可分為海參巖藻聚糖硫酸酯(fucoidan isolated from sea cucumber，SC-FUC)和海參硫酸軟骨素兩種組分。其中，SC-FUC是一類主要由巖藻糖組成的硫酸多糖，屬于巖藻聚糖硫酸酯類化合物，主要存在于褐藻門植物和棘皮動(dòng)物體內(nèi)。目前，有關(guān)褐藻巖藻聚糖硫酸酯的生物活性有較多報(bào)道，例如，抗氧化、抗腫瘤、降脂、降血壓、保護(hù)肝臟、增強(qiáng)免疫力等［2-6］。與褐藻巖藻聚糖硫酸酯相比，SC-FUC化學(xué)結(jié)構(gòu)差異較大［7-8］，其活性僅在抗凝血、增強(qiáng)免疫力等方面有少量報(bào)道［9-10］。海地瓜(Acaudina molpadioides)為芋海參科棘皮動(dòng)物，俗稱海茄子，盛產(chǎn)于亞熱帶沙質(zhì)海區(qū)，在我國的海南、廣東、福建、浙江沿海等地資源量豐富，市場價(jià)格低廉［11］。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明，海地瓜體壁富含SC-FUC(約占干重4%)，但目前對海地瓜的開發(fā)利用仍處初級加工水平。本實(shí)驗(yàn)利用從海地瓜中制備的SC-FUC研究了其對過量飲酒小鼠的防醉和保護(hù)作用，以期找到一種有效的解酒護(hù)肝食品或藥品，以及為低值海參的高值化利用提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1海地瓜海地瓜(A.Molpadioides)，購于山東省青島市南山水產(chǎn)品市場。

1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物健康ICR小鼠，♂，體質(zhì)量18～22 g，SPF級，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，合格證號為SCXK(京)2006-2009。

1.3藥品與試劑白酒(紅星二鍋頭，乙醇含量56%)為北京紅星股份有限公司產(chǎn)品，復(fù)方益肝靈片為江蘇中興藥業(yè)有限公司產(chǎn)品，ALT、AST、ADH、MDA、GSH-Px、CAT試劑盒均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品，ALD試劑盒為長春匯力生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，其它試劑為國產(chǎn)分析純。

1.4儀器GL-20M高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘儀離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品;數(shù)顯恒溫水浴鍋，金壇市雙捷實(shí)驗(yàn)儀器廠產(chǎn)品;CA-958系列半自動(dòng)生化分析儀，長春光機(jī)醫(yī)療儀器有限公司產(chǎn)品;WFJ 2000型可見分光光度計(jì)，尤尼柯(上海)儀器有限公司產(chǎn)品;Model 680型酶標(biāo)儀，Bio RAD產(chǎn)品;MP200型電子天平，上海精密科學(xué)儀器有限公司產(chǎn)品。

2 方法

2.1海參巖藻聚糖硫酸酯制備海地瓜干品經(jīng)粉碎、丙酮浸泡脫脂后，室溫晾干。將海參干粉與木瓜蛋白酶按10∶1比例混合酶解，離心(4 000 r·min-1，15 min，20 ℃)，向上清液中加入氯化十六烷基吡啶沉淀多糖。將沉淀溶解于3 mol·L-1NaCl∶乙醇(100∶15，V/V)溶液，用體積分?jǐn)?shù)為95%的乙醇沉淀過夜。沉淀分別經(jīng)體積分?jǐn)?shù)為80%和95%的乙醇洗滌、60℃干燥、蒸餾水溶解、超濾脫鹽、濃縮、凍干，得海參粗多糖。將海參粗多糖按1∶30(W/V)溶于 25 mmol·L-1pH 6.3 磷酸緩沖溶液，采用Q sepharose fast flow陰離子交換柱，以2.0～2.5 mol·L-1NaCl溶液(25 mmol·L-1NaH2PO4-Na2HPO4，pH 6.3)梯度洗脫，流速為 5 ml·min-1。收集、凍干，得 SC-FUC［12-13］。采用 PMP 柱前衍生-HPLC法測得其單糖組成絕大部分為巖藻糖，采用離子色譜法測得其硫酸根含量為26.3%。

2.2動(dòng)物分組和實(shí)驗(yàn)健康♂ ICR小鼠50只，適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d后，按體重隨機(jī)分為5組，正常對照組(灌服等體積生理鹽水)、模型對照組(灌服等體積生理鹽水)、益肝靈陽性對照組(150 mg·kg-1·d-1)、SC-FUC 低劑量組(50 mg·kg-1·d-1)、SCFUC(100 mg·kg-1·d-1)高劑量組，每組10只。各組小鼠根據(jù)體質(zhì)量按8 ml·kg-1預(yù)灌胃受試物3 d，于末次給藥后當(dāng)晚禁食不禁水8 h，小鼠先灌胃上述劑量受試物，1 h后，藥物組和模型對照組小鼠根據(jù)體重15 ml·kg-1灌胃白酒，正常對照組灌胃同體積生理鹽水。觀察小鼠活動(dòng)情況，記錄小鼠翻正反射消失和恢復(fù)的時(shí)間(即醉酒和醒酒時(shí)間)。以小鼠1 min內(nèi)能否進(jìn)行3次反正反射為醉酒標(biāo)準(zhǔn)［14］。小鼠灌胃白酒24 h后，摘眼球取血，常規(guī)分離血清，備用。快速剝離肝臟，稱重，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血清ALT和AST活力測定參照試劑盒方法測定血清ALT和AST活力，結(jié)果以卡門氏單位表示。卡門氏單位表示定義:1 ml血清1 min內(nèi)所生成的丙酮酸，使NADH氧化成NAD+引起吸光度每下降0.001為一個(gè)單位。

2.4肝臟勻漿液的制備約取肝臟0.3 g，冷生理鹽水漂洗，濾紙拭干，將肝臟與冷生理鹽水1∶9混合勻漿，離心(8 000 r·min-1，15 min，4 ℃)，取上清，-80℃保存待測。蛋白含量采用雙縮脲法測定。

2.5肝臟有關(guān)生化指標(biāo)的測定肝組織 ADH、ALD、CAT、GSH-Px、SOD活性和MDA含量均按試劑盒方法進(jìn)行測定。

2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析數(shù)據(jù)以±s表示，采用SPSS 11.0軟件進(jìn)行 One Way ANOVA分析，同時(shí)進(jìn)行LSD比較。

3 結(jié)果

3.1對小鼠醉酒和醒酒時(shí)間的影響由Tab 1可見，SC-FUC低、高劑量均能明顯推遲小鼠醉酒時(shí)間，SC-FUC低劑量組小鼠醒酒時(shí)間較模型對照組提前了19.08%，表明SC-FUC能有效提高小鼠對酒精的耐受能力。

Tab 1 Effects of SC-FUC on the time of ebriety and sobriety of mice(±s，n=10)

Tab 1 Effects of SC-FUC on the time of ebriety and sobriety of mice(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model

Group Time of ebriety/min Time of sobriety/min Model control 5.78 ±1.03 450.00 ±12.06 Positive control 7.13 ±2.67 396.57 ±86.46 SC-FUC low dose 7.86 ±1.64* 364.14 ±103.19 SC-FUC high dose 8.88 ±2.32＊＊418.50 ±43.87

3.2對小鼠血清ALT和AST活力的影響AST和ALT主要分布在肝臟和心肌中，其在血液中活力的高低反映了肝臟的受損傷程度。與正常對照組比較，模型對照組小鼠血清ALT和AST活力分別提高了48.1%和65.3%(P＜0.05)。灌胃 SC-FUC 各劑量組均能明顯降低小鼠血清ALT和AST的活力(P＜0.01)，分別較模型對照組小鼠平均降低了37.3%和47.3%，表明SC-FUC能明顯拮抗酒精對肝臟的損傷，結(jié)果見Tab 2。

3.3對小鼠肝臟ADH和ALD活力的影響ADH和ALD是機(jī)體乙醇代謝關(guān)鍵酶，乙醇經(jīng)ADH催化氧化成乙醛，乙醛再經(jīng)過ALD催化氧化成乙酸，后者以乙酰CoA的形式進(jìn)入三羧酸循環(huán)，最后氧化成CO2和H2O排出體外［15］。由Tab 2可見，模型對照組小鼠肝臟ADH活力較正常組明顯降低，與正常對照組相比，SC-FUC低劑量組小鼠肝臟ADH和ALD活力較模型對照組均有明顯升高，分別升高了34.3%(P＜0.01)和45.2%(P＜0.01)。高劑量組的ADH和ALD活力較模型對照組差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明適量SC-FUC能明顯促進(jìn)小鼠肝臟中乙醇的代謝。

3.4對小鼠抗氧化能力的影響由Tab 3可見，SC-FUC能提高小鼠肝臟 GSH-Px、CAT和 SOD活力，降低MDA含量。與模型對照組比較，藥物組小鼠的肝臟GSH-Px、CAT和SOD活力平均分別提高了34.4%、17.5%和18%。劑量組小鼠的 MDA含量較模型對照組平均降低34.25%，其中以低劑量組差異有顯著性。說明適量SC-FUC能有效提高小鼠肝臟的抗氧化能力。

Tab 2 Effects of SC-FUC on the activities of ALT and AST in mouse serum and ADH and ALD in mouse liver(±s，n=10)

Tab 2 Effects of SC-FUC on the activities of ALT and AST in mouse serum and ADH and ALD in mouse liver(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group

Group ALT/U·L-1 AST/U·L-1 ADH/kU·g-1Pro ALD/kU·g-1Pro Normal control 28.71 ±4.02 23.33 ±4.16 4.38 ±0.34 2.79 ±0.21 Model control 42.53 ±12.48# 38.57 ±11.99## 3.09 ±0.39# 4.84 ±0.74#Positive control 25.13 ±5.54＊＊ 23.30 ±4.86＊＊ 4.54 ±1.00＊＊ 6.25 ±1.18 SC-FUC low dose 27.42 ±9.31＊＊ 21.96 ±6.66＊＊ 4.15 ±0.70＊＊ 7.03 ±1.83*SC-FUC high dose 25.92 ±6.82＊＊ 18.70 ±3.02＊＊3.49 ±0.84 5.67 ±1.04

Tab 3 Effect of SC-FUC on the activities of GSH-Px，CAT，SOD and the content of MDA in mouse liver(±s，n=10)

Tab 3 Effect of SC-FUC on the activities of GSH-Px，CAT，SOD and the content of MDA in mouse liver(±s，n=10)

*P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs model group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs normal group

Group GSH-Px/kU·g-1Pro CAT/kU·g-1Pro MDA/mmol·g-1Pro SOD/kU·g-1Pro Normal control 524.49 ±61.99 11.70 ±1.43 1.42±0.20 177.69 ±29.28 Model control 420.49 ±73.57# 10.04 ±0.45 3.99 ±1.40## 191.40 ±41.41 Positive control 509.21 ±53.66* 12.54 ±1.33* 2.59 ±0.72* 201.64 ±31.12 SC-FUC low dose 601.19 ±43.98＊＊ 12.83 ±1.56* 2.05 ±0.36＊＊ 233.73 ±10.43 SC-FUC high dose 528.80 ±11.62*10.76 ±2.24 3.2 ±0.93 217.96 ±24.59

4 討論

目前，研究解酒藥物是以降低飲酒者血中乙醇及其代謝產(chǎn)物的濃度，減輕各器官受到的損傷為核心。乙醇被機(jī)體吸收后，在ADH的催化下可被脫氫氧化為乙醛。乙醛具有很強(qiáng)的毒性，是導(dǎo)致肝損傷的直接作用者［16］，它能使肝細(xì)胞內(nèi)線粒體受損，在黃嘌呤氧化酶作用下形成超氧化物，引起脂質(zhì)過氧化，導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。另外，乙醛還與蛋白質(zhì)結(jié)合形成乙醛復(fù)合體，導(dǎo)致蛋白質(zhì)功能紊亂，導(dǎo)致肝細(xì)胞再次受損［17］。乙醛在肝臟內(nèi)經(jīng)ALD繼續(xù)被氧化成乙酸，最后以乙酰CoA的形式進(jìn)入三羧酸循環(huán)。乙醇代謝的整個(gè)過程中有大量活性氧生成，導(dǎo)致肝細(xì)胞脂質(zhì)過氧化反應(yīng)引起肝細(xì)胞損傷［18］。據(jù)乙醇在機(jī)體內(nèi)的代謝特點(diǎn)，解酒藥物主要從兩方面發(fā)揮作用:其一、抑制酒精的胃腸吸收，加強(qiáng)乙醇在胃腸道的首過效應(yīng);其二、藥物直接作用于肝代謝酶系，加速乙醇及其代謝產(chǎn)物的清除速率，減輕其對組織細(xì)胞的損害［19］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SC-FUC能夠有效推遲小鼠醉酒時(shí)間，縮短醒酒時(shí)間，明顯提高小鼠肝臟ADH和ALD活力，提示SC-FUC能明顯促進(jìn)乙醇在小鼠體內(nèi)的代謝，具有明顯的防醉和解酒作用。

肝臟是機(jī)體含酶最豐富的臟器，當(dāng)肝臟受到實(shí)質(zhì)性損害時(shí)，會(huì)引起血清中ALT和AST活性升高。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SC-FUC能明顯降低血清中ALT和AST活性，提示SC-FUC具有明顯地保肝護(hù)肝作用。

SOD、CAT和GSH-Px均為機(jī)體重要的抗氧化酶。其中，SOD專一性的清除超氧陰離子自由基，有明顯的抗脂質(zhì)過氧化作用。CAT能阻止H2O2轉(zhuǎn)變?yōu)椤H，并使之分解為H2O和O2。GSH-Px也能催化H2O2的分解，降低機(jī)體內(nèi)·OH的水平，從而保護(hù)生物膜［20］。大量研究表明，褐藻類巖藻聚糖硫酸酯有明顯的抗氧化作用。例如，半葉馬尾藻巖藻聚糖硫酸酯［21］、海帶巖藻聚糖硫酸酯［22］對自由基具有較高的清除能力。任丹丹等［23］研究發(fā)現(xiàn)海帶巖藻聚糖硫酸酯對四氯化碳引起的肝損傷小鼠有一定的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，SC-FUC能明顯提高小鼠肝臟CAT和GSH-Px活力，降低MDA含量，這與褐藻巖藻聚糖硫酸酯的文獻(xiàn)報(bào)道相似。提示SC-FUC可促進(jìn)乙醇代謝過程中生成大量活性氧的清除，降低肝細(xì)胞的脂質(zhì)過氧化程度，起到保護(hù)肝臟的作用。

綜上所述，SC-FUC具有明顯的防醉酒、促進(jìn)醒酒和保護(hù)肝臟作用，其作用機(jī)制與提高肝臟ADH和ALD活力，加速乙醇的代謝過程，同時(shí)提高肝臟抗氧化能力，降低活性氧自由基對肝細(xì)胞膜上脂質(zhì)和蛋白的損傷，維持細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)與功能完整性有關(guān)。SC-FUC是否能夠抑制胃腸對酒精的吸收，尚需進(jìn)一步研究。本實(shí)驗(yàn)為SC-FUC作為一種功效因子在功能食品或藥品方面的深度開發(fā)，以及低值海參的高值化加工和利用提供了理論依據(jù)。

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