原矛頭蝮蛇毒中一個新穎雙鏈纖溶酶的分離純化與性質(zhì)研究

季仁升，孫黔云，乙 引

(1.貴州師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，貴州貴陽 550001;2.貴州省中國科學(xué)院天然產(chǎn)物化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗室，貴州貴陽 550002)

蛇毒中含有大量以蛋白質(zhì)為主的生物活性物質(zhì)，主要影響機(jī)體的血液循環(huán)系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和肌肉組織等，開展蛇毒研究對蛇傷防治、相關(guān)生命科學(xué)研究、新藥研發(fā)具有重要的意義和價值［1］。原矛頭蝮蛇(Protobothrops mucrosquamatus)，又稱烙鐵頭蛇(Trimeresurus mucrosquamatus)，屬蝰蛇科原矛頭蝮屬，主要分布在我國的南方地區(qū)和臺灣地區(qū)，是一種常見劇毒蛇，屬血循毒。其蛇傷臨床表現(xiàn)主要為出血、腫脹、嚴(yán)重時流血不止。迄今為止，已經(jīng)從原矛頭蝮蛇毒中分離純化出數(shù)個蛋白，涉及L-氨基酸氧化酶、磷脂酶 A2、凝集素、纖溶酶等［2－4］，但總體上對其研究較少。本文報道了湖南產(chǎn)原矛頭蝮蛇毒中一個新穎絲氨酸蛋白酶的分離純化與相關(guān)性質(zhì)研究。

1 材料與方法

1.1材料原矛頭蝮蛇毒采集于湖南省武陵山區(qū);蛋白分離介質(zhì) DEAE Sephadex A-50凝膠、Sephadex G-75凝膠、Sephacrycl S-100凝膠、Heparin HP凝膠、Hitrap Q HP預(yù)裝柱、低分子量蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)Marker、凝膠過濾測定分子量試劑盒、兩性電解質(zhì)Ampholine(pH 3.5～10)均購自瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司;兔抗綿羊紅細(xì)胞抗體(溶血素)、乙二醇雙(2-氨基乙醚)四乙酸(ethylene glycol-bis(β-aminoethyl ether)-N，N，N'，N'-tetraacetic acid，EGTA)、牛纖維蛋白原、苯甲酰-L-精氨酸乙酯(Nα-Benzoyl-L-arginine ethyl ester hydrochloride，BAEE)、偶氮酪蛋白(azocasein)、十二烷基硫酸鈉(SDS)購自美國Sigma公司;增強(qiáng)型BCA蛋白定量試劑盒購自江蘇碧云天生物技術(shù)研究所;綿羊紅細(xì)胞采自貴陽醫(yī)學(xué)院實(shí)驗動物中心，混合人血清由本實(shí)驗室健康志愿者獻(xiàn)血制備而得;昆明種小鼠購自第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院實(shí)驗動物中心，合格證號:SCXK(渝)2007-0005;其它試劑均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純。

1.2儀器AKTA Prime蛋白層析系統(tǒng)、Gene Quant紫外分光光度計(瑞典Amersham Pharmacia Biotech公司);Spectra MAX-190連續(xù)波長酶標(biāo)儀(美國MD公司);5810R冷凍離心機(jī)(德國Eppendorf公司);FDU-1100冷凍干燥機(jī) (日本東京理化器械株式會社);DYY-8C電泳儀、DYCZ-24D電泳槽(北京市六一儀器廠)。

1.3方法

1.3.1目標(biāo)蛋白的分離純化1.0 g原矛頭蝮蛇粗毒凍干粉溶于7 ml的50 mmol·L－1pH 8.9 Tris-HCl緩沖液中，離心后取上清上樣于DEAE Sephadex A-50陰離子交換柱(2.6 cm×90 cm)，充分洗脫后用0 ～0.4 mol·L－1NaCl(1 000 ml∶1 000 ml)線性洗脫，流速為 24 ml·h－1，每管收集 6 ml，檢測纖維蛋白原水解活性，收集相關(guān)活性峰，凍干后溶于PBS緩沖液，上樣于Sephadex G-75凝膠(1.6 cm×75 cm)，流速為 15 ml·h－1，每管 3 ml，收集活性峰濃縮，脫鹽，上樣于肝素親和柱(1.0 cm×15 cm)，在AKTA Primer上進(jìn)行分離純化，流速為2 ml·min－1，收集活性峰，再采用 HiTrap Q HP 1 ml預(yù)裝柱分離純化，流速為1 ml·min－1，收集活性峰，12%SDS-PAGE測定純度。

1.3.2分子量和等電點(diǎn)的測定12%SDS-PAGE測定目標(biāo)蛋白在還原與非還原條件下的分子量。凝膠過濾測定分子量采用Sephacrycl S-100凝膠(1.0 cm×60 cm)，按照試劑盒說明書進(jìn)行。變性條件下目標(biāo)蛋白的等電點(diǎn)測定同文獻(xiàn)［5］。

1.3.3蛋白水解活性檢測

1.3.3.1纖維蛋白原水解活性測定 參照文獻(xiàn)［5］的方法加以改動。200 μl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.2% 纖維蛋白原液(400 μg，50 mmol·L－1Tris-HCl，pH 7.5，0.15 mol·L－1NaCl配制)加入 100 μl PMSP-A(含20 μg)于 37℃水浴孵育 1/6、1/2、1、2、3、6、9、12 和24 h后，12%SDS-PAGE檢測。

1.3.3.2纖維蛋白水解活性測定 參照文獻(xiàn)［5］的方法加以改動，取90 mm直徑平皿加入9 ml質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.5%牛纖維蛋白原，再加入300 μl 20 kU·g－1的人凝血酶，混勻后室溫放置2 h，然后加入20 μl PMSP-A(含20 μg)，37℃孵育 24 h 后，觀察測量水解圈。原矛頭蝮蛇粗毒為陽性對照。

1.3.3.3精氨酸酯酶活性測定 參考文獻(xiàn)［5］的方法:BAEE 作為底物，100 μl PMSP-A(含 100 μg)加入 3 ml BAEE(1 mol·L－1，67 mmol·L－1，pH 7.0的PB配制)，于37℃水浴孵育6 h后，253 nm測定吸光度，將每分鐘吸光度上升0.001定義為1個活力單位，原矛頭蝮蛇蛇粗毒為陽性對照。

1.3.3.4偶氮酪蛋白水解活性 測定參照文獻(xiàn)［5］的方法:100 μl PMSP-A(含100 μg)加入1 ml azocasein(5 g·L－1，60 mmol·L－1NaHCO3配制)于37℃水浴孵育6 h后，加入1 ml 1.16 mol·L－1高氯酸終止反應(yīng)，溶液過濾后于390 nm測定吸光度。原矛頭蝮蛇粗毒為對照。

1.3.4酶抑制劑對纖維蛋白原水解活性的影響測定參照文獻(xiàn)［5］的方法:100 μl PMSP-A(含 4 μg)分別與 PMSF(10 mmol·L－1)、EDTA(10 mmol·L－1)、1，10-phenanthroline(10 mmol·L－1)、SBTI(0.5 g·L－1)、EGTA(50 mmol·L－1)在 37 ℃孵育30 min后加入20 μl(含40 μg)牛纖維蛋白原孵育24 h，10%SDS-PAGE檢測纖維蛋白原水解活性。

1.3.5抗補(bǔ)體活性測定抗補(bǔ)體活性經(jīng)典途徑測定參考文獻(xiàn)［6］方法。樣品、人血清(1∶17.5稀釋)各100 μl混勻，37℃水浴預(yù)孵30 min或不預(yù)孵，然后加入100 μl致敏綿羊紅細(xì)胞(5 ×1011cells·L－1)混勻，37℃孵育30 min后再加入1 ml冷生理鹽水終止反應(yīng)，2 000 r·min－1離心10 min，取上清液于412 nm測定吸光度。

1.3.6出血毒活性檢測參照文獻(xiàn)［7］的方法加以改動?！饫ッ鞣N小鼠(體質(zhì)量20～30 g，n=6)背部皮下注射 2.5 μg·g－1PMSP-A，24 h 后皮膚內(nèi)側(cè)檢測出血情況，原矛頭蝮蛇粗毒為陽性對照。

1.3.7水腫活性檢測參照文獻(xiàn)［8］的方法加以改動。昆明種小鼠(體質(zhì)量20～30 g，n=6)隨機(jī)分組，每組♀♂各半，左、右后足分別注射15 μl PMSPA(含5 μg)與PBS緩沖液，2.5 h后處死，在相同位置剪下左、右后足，稱重后計算腫脹率:

1.3.8流血時間測定參照文獻(xiàn)［4］的方法加以改動，昆明種小鼠(體質(zhì)量20～30 g，n=6)隨機(jī)分組，每組♀♂各半，以0.5 μg·g－1的劑量尾部靜脈注射目標(biāo)蛋白，正常對照組注射同等體積的PBS緩沖液，注射30 min后，距尾部末端1.0 cm處切深度1～2 mm的傷口，血液自行流出開始計時，每30 s用濾紙吸去血滴，直至流血停止(以濾紙吸取時無血流出作為流血停止標(biāo)志)。

1.3.9肽指紋圖譜測定純化后的樣品經(jīng)還原SDS-PAGE電泳后，切取含有蛋白的膠條用胰蛋白酶水解，用4700 proteomics Analyzer(Applied Biosystems，USA)進(jìn)行肽指紋圖譜測定。激光源為355 nm波長的Nd:YAG激光器，加速電壓為20 kV，采用正離子模式和自動獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù)。PMF質(zhì)量掃描范圍為700～4 000 u，且強(qiáng)度最大的10個峰進(jìn)行串級質(zhì)譜分析;譜圖用myoglobin酶解肽段進(jìn)行外標(biāo)校正。所得結(jié)果用GPS(Applied Biosystems，USA)–MASCOT(Matrix Science，London，UK)進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索。搜索參數(shù)設(shè)置:數(shù)據(jù)庫為NCBInr;數(shù)據(jù)檢索的方式為combined;最大允許漏切位點(diǎn)為1;質(zhì)量誤差范圍設(shè)置:PMF±100 ppm，MS/MS±0.6 u。

1.3.10統(tǒng)計學(xué)分析本實(shí)驗數(shù)據(jù)采用±s表示，采用SPSS 16.0以t檢驗進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。采用GraphPad Prism 3進(jìn)行作圖分析。

2 結(jié)果

Fig 1 Purification of PMSP-A

2.1PMSP-A的分離純化原矛頭蝮蛇毒經(jīng)DEAE Sephadex A-50陰離子交換層析后取第340～356管(Fig 1A)收集合并上樣于Sephadex G-75凝膠層析柱，取洗脫峰2(21～36管)(Fig 1B)，再經(jīng)Heparin HP親和層析純化，取洗脫得到第一個蛋白峰(Fig 1C)，最后經(jīng)HiTrap Q HP陰離子交換層析得到的目標(biāo)蛋白(Fig 1D)，命名為PMSP-A，SDS-PAGE檢測為一條帶。

2.2分子量與等電點(diǎn)經(jīng)12%SDS-PAGE檢測，PMSP-A在非還原條件下分子量為26.1 ku，還原狀態(tài)下呈現(xiàn)分子量分別是15.1 ku與14.4 ku的兩條多肽鏈(Fig 2A)。經(jīng)Sephacryl S-100凝膠過濾測定，PMSP-A分子量為25.3 ku(Fig 3)。通過等電聚焦電泳測定PMSP-A的兩條肽鏈的等電點(diǎn)分別為5.7與6.1(Fig 2B)。

Tab 1 Theoretical and experimental peptide masses of PMSP-A

Fig 2 Electrophoresis of PMSP-A

2.3蛋白水解活性及抑制劑對蛋白質(zhì)水解酶活性的影響

2.3.1纖維蛋白原水解活性PMSP-A能夠依次水解纖維蛋白原的Bβ鏈，Aα鏈，孵育24 h內(nèi)沒有檢測到水解γ鏈(Fig 4)。

2.3.2抑制劑對纖維蛋白原水解活性影響PMSP-A的纖維蛋白原水解活性受PMSF、1，10-phenan-throline的抑制，EDTA、EGTA、SBTI不能抑制其水解活性(Fig 5)。

Fig 3 Molecular weight determination of PMSP-A by gel filtration on a Sephacryl S-100 column

Fig 4 Fibrinogenolytic activity of PMSP-A

Fig 5 Effect of inhibitors on the fibrinogenolytic activity of PMSP-A

2.3.3纖維蛋白水解活性PMSP-A對纖維蛋白具有水解活性(Fig 6)。

Fig 6 Fibrinolytic activity of PMSP-A

2.3.4其他蛋白水解活性測定PMSP-A的精氨酸酯酶活力單位為8.7 kU·g－1，它沒有偶氮酪蛋白水解活性。

2.4肽指紋圖譜分析肽指紋圖譜測定PMSP-A與黃綠烙鐵頭蛇毒中C-型凝集素二聚體中鏈A的部分肽段吻合。

2.5抗補(bǔ)體活性預(yù)孵條件下終濃度為0.075 g·L－1的PMSP-A對補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血有(55.59±5.22)% 的抑制率，在不預(yù)孵條件下只有微弱的抑制活性(4.66±1.50)%。

2.6出血活性以2.5 μg·g－1劑量的 PMSP-A注射到小鼠皮下，24 h后未見出血斑點(diǎn)。

2.7水腫活性5 μg PMSP-A注射到小鼠足趾，2 h后引起的腫脹率為(14.55±3.13)%，見Fig 7。

Fig 7 Effect of PMSP-A on inducing edema of mice paw

2.8對流血時間的影響0.5 μg·g－1劑量的PM-SP-A注射到小鼠尾靜脈，與PBS對照組(502.20±172.25)s相比，PMSP-A能夠明顯延長小鼠尾靜脈的流血時間(803.57±224.28)s。

3 討論

本研究從湖南產(chǎn)原矛頭蝮蛇毒中分離純化得到一個具有纖溶活性的酸性蛋白酶PMSP-A，其由兩條非均等的肽鏈共價鍵組成，分子量(25～26)ku。它能夠依次水解纖維蛋白原的Bβ、Aα鏈，活性能夠被PMSF抑制，EDTA、EGTA不能抑制其活性，且具有精氨酸酯酶活性，提示PMSP-A為絲氨酸蛋白酶。PMSP-A對纖維蛋白也具有水解活性，同時它能抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血，PMSP-A能明顯延長小鼠尾靜脈的流血時間，引起小鼠足趾水腫，無出血毒活性。

非還原SDS-PAGE和凝膠過濾檢測PMSP-A為單一蛋白，還原SDS-PAGE則表現(xiàn)為兩條非均等的多肽鏈，表明PMSP-A是由兩條非均等肽鏈共價組成。這種肽鏈的不均等可能是由于蛋白質(zhì)后期修飾造成的差異，也可能是兩條不同的肽鏈。迄今為止，只在我國臺灣地區(qū)產(chǎn)原矛頭蝮蛇毒中發(fā)現(xiàn)過兩個雙鏈結(jié)構(gòu)的蛋白，其中一個是具有血小板凝集活性但無纖維蛋白原水解活性的雙鏈蛇毒蛋白［9］，另外一個是也具有血小板凝集活性的C-型凝集素［3］。因此，可以認(rèn)為PMSP-A是首次從原矛頭蝮蛇毒中發(fā)現(xiàn)的雙鏈絲氨酸蛋白酶。

蛇毒絲氨酸蛋白酶具有纖維蛋白(原)水解活性，在血管疾病治療方面有著廣泛的價值，目前已有數(shù)種蛇毒絲氨酸蛋白酶制劑如 Ancrod、Batroxobin等在臨床應(yīng)用［10－11］。本工作中的 PMSP-A具有纖維蛋白(原)水解活性，能明顯延長小鼠尾靜脈的流血時間，提示它具有抗凝活性。PMSP-A抗凝的作用是否只與其水解纖維蛋白(原)有關(guān)，以及其影響血液凝固的機(jī)制尚待進(jìn)一步的研究。

通過肽指紋圖譜分析，PMSP-A的部分肽段與黃綠烙鐵頭(Trimeramaturus flavoviridis)蛇毒中一個具有抗凝活性的C型凝集素中異源二聚體中的鏈A部分序列吻合［12－13］。本實(shí)驗純化得到的 PMSP-A也能延長小鼠尾靜脈流血時間，提示目標(biāo)蛋白結(jié)構(gòu)與功能間的內(nèi)在聯(lián)系。開展PMSP-A的結(jié)構(gòu)研究將有助于加深對蛇毒絲氨酸蛋白酶結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系的理解和認(rèn)識。

補(bǔ)體系統(tǒng)是機(jī)體免疫防御的第一道防線，具有重要的免疫調(diào)節(jié)作用。從蛇毒中已分離純化出一些具有抗補(bǔ)體作用的蛋白酶，這些蛋白酶主要是通過酶切的方式作用于補(bǔ)體，例如從黃綠烙鐵頭蛇毒中分離出的絲氨酸蛋白酶flavoxobin［14］，它具有C3/C5轉(zhuǎn)化酶活性，能酶切補(bǔ)體C3、C5，生成生理活性片段。本課題組從原矛頭蝮蛇毒中純化得到了一個具有抗補(bǔ)體活性的金屬蛋白酶TMAC-1，它能夠裂解補(bǔ)體C3和C5，但酶切產(chǎn)物不能激活內(nèi)皮細(xì)胞釋放P-selectin［15］。PMSP-A在預(yù)孵條件下能明顯抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血，但不預(yù)孵條件下幾乎不能抑制補(bǔ)體經(jīng)典途徑溶血，表明PMSP-A是通過酶切方式作用于補(bǔ)體系統(tǒng)。補(bǔ)體系統(tǒng)和血液系統(tǒng)中起關(guān)鍵作用的酶都是絲氨酸蛋白酶。PMSP-A是蛇毒絲氨酸蛋白酶，它既能作用于補(bǔ)體，又能影響血液的正常凝集，其酶切補(bǔ)體只是偶然的底物適配或是具有特殊的生物學(xué)功能和意義，值得進(jìn)一步研究探討。

本工作從湖南產(chǎn)原矛頭蝮蛇毒中分離純化出一個新穎的雙鏈絲氨酸蛋白酶PMSP-A，它具有纖維蛋白(原)水解活性，能明顯延長小鼠尾靜脈流血時間，同時它也具有抗補(bǔ)體活性。本研究將能加深對原矛頭蝮蛇毒蛇傷的認(rèn)識和理解，能為其蛇傷防治提供有益的思路和參考，同時，PMSP-A對血液系統(tǒng)的作用和潛在應(yīng)用值得進(jìn)一步研究評價。

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