FQ-PCR檢測人腸道乳酸桿菌的研究

馮玉奎，鄭長青，孫英姿，高 波

乳酸桿菌（Lactobacillus）是在乳酸菌中與動物關系最密切的菌屬，動物和人類從口腔到直腸始終有該菌存在，是動物腸道中占優(yōu)勢的菌群之一。當動物消化道中乳酸桿菌的比率下降，則動物消化機能紊亂，嚴重者導致動物腸炎、下痢等疾病。乳酸桿菌的數(shù)量變化往往預示著人身體狀態(tài)發(fā)生變化。因此確切了解乳酸桿菌變化及對乳酸桿菌進行精確定量對疾病的診斷有著重要的意義[1-4]。

本研究依據(jù)乳酸桿菌16S rDNA序列設計屬特異性引物，以常規(guī)PCR產(chǎn)物經(jīng)克隆后的質(zhì)粒DNA為標準品，經(jīng)光譜定量、梯度稀釋后制備標準曲線。抽提腸道菌群的細菌基因組DNA，用實時熒光定量PCR技術定量分析樣品中乳酸桿菌數(shù)量。

該項目完成后，有望建立一種高靈敏度的乳酸桿菌及腸道菌群定量檢測體系，該檢測體系將為定量檢測乳酸桿菌提供有效的實驗手段，并為相關檢測試劑的研制奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 檢測樣品 40份成年健康人糞便。用無菌離心管收集其糞便標本，置在-20℃冰箱保存?zhèn)錂z。

1.1.2 工具酶和試劑 Genomic DNA purification kit、Gel and PCR clean-up system、質(zhì)粒小量純化試劑盒購自購自Promega公司；RealMasterMix(SYBR Green)為北京天根公司產(chǎn)品；pMD18simple-T vector、ExTaq DNA 聚合酶、DNA Marker DL2000等購自日本TAKARA生物工程公司；MRS培養(yǎng)基購自北京陸橋技術有限責任公司。

1.1.3 儀器 本研究中所用的定量PCR儀為美國應用生物系統(tǒng)公司ABI Prism 7000型熒光定量PCR儀。

1.2 乳酸桿菌的傳統(tǒng)活菌計數(shù) 乳酸桿菌的活菌計數(shù)依標準方法精確取0.1 g糞便利用MRS培養(yǎng)基培養(yǎng)計數(shù)，其詳細步驟見文獻[5]。

1.3 FQ-PCR引物的設計 利用DNAMAN引物設計軟件設計擴增乳酸桿菌的引物。所選用的上下游引物如下， 引物 1：5'CTGATG AAAGCCCTCG3'；引物 2：5-GAGCCTCAGCGTCAGTG 3'； 擴增片段為230bp。引物序列經(jīng)過BLAST檢索（www.ncbi.nlm.nih.gov/blast），具有很強的特異性。引物由北京三博遠志有限公司合成。

1.4 病原菌DNA的提取 糞便標本于常溫下融凍，取0.1 g大便，加10 ml磷酸鹽緩沖液，充分混勻5 min；1000 r/min離心 10 min，取上清液，利用Promega公司的細菌基因組DNA提取試劑盒進行，過程參照其說明書。所有乳酸桿菌基因組DNA，于-20℃保存。

1.5 常規(guī)PCR反應 取乳酸桿菌基因組DNA抽提液進行常規(guī)PCR反應。反應體系為50 μl，10×PCR buffer 5 μl，10 mmol/L dNTP 混合物 4 μl，上、下游引物各10pmol，Ex Taq DNA聚合酶2.5U，加去離子水至50 μl。PCR擴增程序為：94℃變性5 min；94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s，循環(huán) 42次；72℃延伸5 min。在擴增結束后取PCR產(chǎn)物10 μl與DNA Marker DL 2000同時進行2%瓊脂糖凝膠電泳。

1.6 標準品質(zhì)粒的構建 將PCR擴增產(chǎn)物進行純化回收并與pMD18simple-T載體連接，轉化大腸桿菌E.coli Top10，經(jīng)藍白斑篩選，隨機挑取4個白色克隆，菌落PCR鑒定得到陽性克隆后，小量制備質(zhì)粒DNA，再進行PCR鑒定并送北京華大中生公司測序。用紫外分光光度計準確定量后，根據(jù)以下公式計算出其拷貝數(shù)，進行10倍梯度稀釋，作為標準品保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.7 實時定量PCR檢測乳酸桿菌的數(shù)量

1.7.1 標準曲線的建立 以10倍梯度稀釋的質(zhì)粒標準品為模板，進行實時熒光定量PCR。PCR反應在 20 μl體系中進行， 包括 RealMasterMix（SYBR Green）9 μl，模板 1 μl，上、下游引物各 10 pmol，加無菌去離子水至20 μl。PCR擴增程序為：94℃變性5 min；94℃ 30 s→56℃ 30 s→72℃ 30 s， 循環(huán)42次；read plates，72℃延伸5 min。用起始模板拷貝數(shù)的lg值對每個稀釋標準品的CT值繪圖，得到標準曲線。

1.7.2 乳酸桿菌數(shù)量的測定 實時定量PCR反應體系及反應條件同上，對40份乳酸桿菌基因組DNA樣品進行檢測，同時設陰性對照（不加模板）及陽性對照。根據(jù)測得的CT值與標準曲線得到樣品中DNA拷貝數(shù)。

1.8 統(tǒng)計學處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，所得結果經(jīng)對數(shù)轉換后以 x（lgx）±s（lgx）表示，采用單因素方差分析方法分析熒光定量PCR和傳統(tǒng)培養(yǎng)對于乳酸桿菌定量的差別。

2 結 果

2.1 標準品質(zhì)粒的構建與鑒定 標準品質(zhì)粒的PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，擴增片段大小符合預期約230bp，結果見圖1。

圖1 乳酸桿菌標準品質(zhì)粒PCR檢測結果

2.2 標準曲線的建立 標準品質(zhì)?？截悢?shù)以104～108copies/μl的梯度稀釋的標準品質(zhì)粒為模板，進行實時熒光定量PCR。標準品擴增曲線如圖2，標準品熔點曲線如圖3，建立標準曲線如圖4。標準曲線的直線回歸相關系數(shù)r=－0.996 6。

圖2 乳酸桿菌標準品擴增曲線

圖3 乳酸桿菌標準品熔點曲線

圖4 標準曲線圖

2.3 檢測樣品中DNA數(shù)量的測定 各糞便樣品基因組DNA用定量PCR進行檢測，根據(jù)CT值與標準曲線計算得到每克標本中乳酸桿菌的數(shù)量。與培養(yǎng)法相比，熒光定量PCR檢測所得結果與培養(yǎng)方法獲得的結果接近（P>0.05）。見表1。

表1 兩種方法所得結果（±s拷貝數(shù)/g濕便）

表1 兩種方法所得結果（±s拷貝數(shù)/g濕便）

細菌 定量PCR法 培養(yǎng)法 T值 P值乳酸桿菌 9.3±1.5 8.9±1.3 1.215 0.087

3 討 論

FQ-PCR技術創(chuàng)立于1996年，由美國Applied Biosystems公司推出，是一種在PCR定性技術基礎上發(fā)展起來的核酸定量技術。FQ-PCR技術是通過在PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號的變化實時檢測PCR擴增反應中每一個循環(huán)擴增產(chǎn)物量的變化，通過Ct值和標準曲線的分析對起始模板進行定量分析。FQ-PCR技術融合PCR技術和DNA探針雜交技術的優(yōu)點，直接探測PCR過程中熒光信號的變化使PCR的擴增及其分析過程均在同一封閉系統(tǒng)下完成，并在電腦分析軟件支持下實現(xiàn)對PCR擴增產(chǎn)物的動態(tài)監(jiān)測和自動定量，現(xiàn)在已廣泛應用于生物學、基礎醫(yī)學、疾病診斷、食品、水質(zhì)環(huán)保、藥物開發(fā)等領域，被認為是核酸定量的金標準[6，7]。

腸道菌群的微生態(tài)平衡與人的健康及疾病有著密切的關系[8-10]。正常人腸道中的菌群，主要為厭氧菌，少數(shù)為需氧菌，前者約為后者的100倍。存在于腸道的正常菌群為類桿菌、乳桿菌、大腸桿菌和腸球菌等，尚有少數(shù)過路菌，如金黃色葡萄球菌、綠膿桿菌、副大腸桿菌、產(chǎn)氣桿菌、變形桿菌、產(chǎn)氣莢膜桿菌、白色念珠菌等。在正常情況下，這些微生物互相依存，互相制約，維持平衡，保持一定的數(shù)量和比例[11-13]。在人體抵抗力降低的情況下，如瘦弱嬰幼兒，年老體弱和患急、慢性疾病者，以及長期、大量使用廣譜抗生素、免疫抑制劑、腎上腺皮質(zhì)激素、抗腫瘤藥物和放射治療者，尤其是應用廣譜抗生素者，可使腸道正常菌群被抑制而數(shù)量減少，耐藥的過路菌過量繁殖，造成腸道菌群失調(diào)。出現(xiàn)臨床癥狀者，稱為腸道菌群失調(diào)癥[14-17]。因此確切了解腸道菌群變化及對腸道菌群進行精確定量對疾病的診斷有著重要的意義。

傳統(tǒng)的乳酸桿菌檢測方法是基于細菌的形態(tài)學、生理學和生物化學特征，在特殊培養(yǎng)基上經(jīng)厭氧培養(yǎng)、菌落計數(shù)來實現(xiàn)的，其過程易受細菌離體時間、外界環(huán)境因素、培養(yǎng)基性能和非特異性菌落混雜等多種因素影響，檢測失敗率高，結果缺乏穩(wěn)定性和可靠性，且費時費力，計數(shù)不精確，屬半定量檢測。

本研究應用熒光定量PCR的方法對健康人群的腸道菌群中的乳酸桿菌進行了定量分析，并和傳統(tǒng)方法進行了比較。其結果和其它文獻報道的用培養(yǎng)的方法得到的結果接近，也說明了熒光定量PCR法可以準確特異地對腸道菌群進行定量。此技術為進一步研究實驗動物和人腸道菌群的組成及其動態(tài)變化提供了有效的檢測手段，具有較好的實驗研究和臨床應用的前景。

[1]李蘭娟.感染微生態(tài)學[M].北京:人民衛(wèi)生出版社，2002，224：100.

[2]Serrazanetti DI,Guerzoni ME,Corsetti A,et al.Metabolic impact and potential exploitation of the stress reactions in lactobacilli[J].Food Microbiol,2009,26(7):700-711.

[3]王曉華，夏文涵，王曉剛，等.腸道菌群失調(diào)癥的研究進展[J].實用臨床醫(yī)學，2007，8(8)：136-138.

[4]Guerrero HI,Torre DA,Vargas VF,et al.Intestinal flora,probiotics,and cirrhosis[J].Ann Hepatol,2008,7(2):120-124.

[5]張 艷，劉均娥，張 晶，等.平板活菌計數(shù)法檢測糞便中的腸道菌群[J].首都醫(yī)科大學學報，2008，(29)2：85-86.

[6]Felkin LE,Taeganeyer AB,Barton PJ.Real-time quantitative polymerise chain reaction in cardiac transplant research[J].Methods Mol Biol,2006,333:305-330.

[7]Deng SX,Cheng AC,Wang MS.Quantitative studies of the regular distribution pattern for Salmonella enteritidis in the internal organs of mice after oral challenge by a specific real-time polymerase chain reaction[J].World J Gastroenterol,2008,14(5):782-789.

[8]Rescigno M.The pathogenic role of intestinal flora in IBD and colon cancer[J].Curr Drug Targets,2008,9(5):395-403.

[9]Tapiainen T,Ylitalo S,Eerola E,et al.Dynamics of gut colonization and source of intestinal flora in healthy newborn infants[J].APMIS,2006,114(11):812-817.

[10]Chrzastowska M,Kander M,Depta A.Prospects for the use of probiotic bacteria in the treatment of gastrointestinal diseases in dogs[J].Pol J Vet Sci,2009,12(2):279-284.

[11]吳 蓉，陳淑潔，姒健敏.腸易激綜合征與腸道微生態(tài)的研究現(xiàn)狀分析[J].國際消化病雜志，2007，10(27)：350-352.

[12]Lanas A,Scarpignato C.Microbial flora in NSAID-induced intestinal damage:a role for antibiotics?[J].Digestion,2006,73:136-150.

[13]Yamano T,Iino H,Takada M,et al.Improvement of the human intestinal flora by ingestion of the probiotic strain Lactobacillus johnsonii La1[J].Br J Nut,2006,95(2):303-312.

[14]Wilcks A,Hansen BM,Hendriksen NB,et al.Fate and effect of ingested Bacillus cereus spores and vegetative cells in the intestinal tract of human-flora-associated rats[J].FEMS Immunol Med Microbiol,2006,46(1):70-77.

[15]Walker C,Preshaw PM,Novak J,et al.Long-term treatment with sub-antimicrobial dose doxycycline has no antibacterial effect on intestinal flora[J].J Clin Periodontol,2005,32(11):1163-1169.

[16]Fang F,O'Toole PW.Genetic tools for investigating the biology of commensal lactobacilli[J].Front Biosci,2009,1(14):3111-3127.

[17]Quigley EM.Probiotics in functional gastrointestinal disorders:what are the facts?[J].Curr Opin Pharmacol,2008,8(6):704-708.