超臨界CO2萃取結(jié)合柱層析法提取和純化丹參中的丹參酮ⅡA

王亞紅,張仰眉,肖 凱

(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)醫(yī)院藥劑處,呼和浩特 010017;2.第二軍醫(yī)大學(xué)海醫(yī)系毒物藥物研究室,上海 200433)

丹參為唇形科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge.)的干燥根及根莖,是我國(guó)的傳統(tǒng)中藥。丹參始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》,味苦、微寒,入心、心包及肝經(jīng),具有活血通絡(luò)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩等功效[1]。丹參的脂溶性成分為二萜醌類化合物,丹參酮及單體都具有抗炎、抗腫瘤、抗氧化、抗動(dòng)脈粥樣硬化、改善心肌缺血等藥理作用,廣泛應(yīng)用于治療心血管病的中成藥制劑,對(duì)治療冠心病、心絞痛、心動(dòng)過(guò)速有顯著療效。丹參酮的提取一般選擇滲漉法或回流提取,在回收溶劑、濃縮、干燥過(guò)程中丹參酮損失嚴(yán)重,資源浪費(fèi)較大。超臨界CO2萃取是以超臨界狀態(tài)下的CO2流體為溶劑來(lái)提取分離混合物的過(guò)程。超臨界流體兼具氣體和液體的雙重特性,具有很強(qiáng)的溶解能力,良好的流動(dòng)性和傳遞性。超臨界CO2萃取通過(guò)調(diào)節(jié)超臨界CO2流體的壓力和溫度來(lái)控制溶解度和蒸氣壓這兩個(gè)參數(shù),從而達(dá)到物質(zhì)分離的效果[2]。本研究采用超臨界CO2萃取結(jié)合柱層析法對(duì)丹參原藥材進(jìn)行提取、分離和純化,以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料和儀器

1.1 儀器 HA221-50超臨界CO2萃取儀(江蘇華安超臨界萃取有限公司);HPLC儀,包括510高壓恒流泵和2487雙波長(zhǎng)檢測(cè)器(美國(guó)Waters公司);N2000色譜工作站(浙江智達(dá)信息工程有限公司);旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海儀器廠);FA1004電子天平(上海天平儀器廠)。

1.2 試劑、藥品和藥材 丹參藥材購(gòu)自河北省安國(guó)市,丹參酮ⅡA含量為0.235%,符合《中華人民共和國(guó)藥典》2010版一部要求[3];丹參酮ⅡA對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110766-200315);乙醇(純度95%,食品級(jí),國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司);CO2(純度99.9%,食品級(jí),上海蓋斯工業(yè)氣體有限公司);中性氧化鋁(100～200目,上海五四化學(xué)試劑廠);甲醇(一級(jí)色譜純,天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司);無(wú)水乙醇、苯(分析純,天津化學(xué)試劑三廠);純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 萃取方法 取已粉碎的丹參藥材粗粉200 g,裝入萃取釜中,當(dāng)萃取釜和分離釜的壓力和溫度都達(dá)到設(shè)定值后,加入夾帶劑乙醇,開始萃取,并記錄時(shí)間。固定CO2流速為 30 L/h,設(shè)定工藝參數(shù),靜態(tài)萃取45 min,動(dòng)態(tài)萃取45 min。在分離釜出口處收集萃取液,量取體積。對(duì)萃取液減壓回收乙醇,真空干燥,得到萃取物粗品。

2.2 丹參酮ⅡA的含量測(cè)定

2.2.1 溶液的配制 (1)對(duì)照品儲(chǔ)備液:精密稱取丹參酮ⅡA對(duì)照品 10.2 mg,置50 ml棕色量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,得到濃度為0.204 mg/ml的對(duì)照品儲(chǔ)備液。取對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,置50 ml棕色量瓶中,用甲醇定容,得到濃度為4.08 μ g/ml的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液。(2)供試品溶液:精密稱取干燥的萃取物粗品0.1 g置50 ml量瓶中,加適量甲醇超聲溶解,再用甲醇稀釋至刻度,用0.45 μ m微孔濾膜濾過(guò),棄去初濾液,取續(xù)濾液0.1 ml置50 ml量瓶中,加甲醇至刻度,搖勻,即得供試品溶液。以甲醇作為陰性對(duì)照品溶液。

2.2.2 色譜條件 色譜柱:Diamonsil C18色譜柱(250 mm ×4.6 mm,5 μ m);流動(dòng)相 :甲醇-水(75∶25);檢測(cè)波長(zhǎng):270 nm;流速 :1.0 ml/min;柱溫 :室溫 ;進(jìn)樣量:10 μ l。在此色譜條件下,取對(duì)照品、陰性對(duì)照品和供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定,得到色譜圖見圖1。由圖1可見,色譜峰分離良好,達(dá)到定量要求。

圖1 丹參酮ⅡA的HPLC譜圖Figure 1 HPLC photograms of tanshinoneⅡA

2.2.3 線性關(guān)系的考察 精密吸取2.2.1項(xiàng)下的對(duì)照品儲(chǔ)備液適量,置50 ml棕色量瓶中,用甲醇定容,得到系列濃度為 1.02 、2.04、4.08、8.16、16.32、32.64 μ g/ml的丹參酮ⅡA對(duì)照品溶液,按2.2.2項(xiàng)下的色譜條件進(jìn)樣測(cè)定,用外標(biāo)法以峰面積定量。將峰面積(A)對(duì)濃度(c)進(jìn)行線性回歸,得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程:A=2.2204×10-7c+3.819 3×10-3,(r=0.999 8,n=5),表明丹參酮ⅡA在 1.02～ 32.64 μ g/ml范圍內(nèi),濃度與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.3 工藝優(yōu)化

2.3.1 萃取條件的選擇 根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定影響萃取效果的4個(gè)主要因素:夾帶劑用量、萃取釜壓力、萃取釜溫度和分離釜溫度。每個(gè)因素設(shè)定3個(gè)水平進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn),考察最佳萃取條件(見表1)。

2.3.2 正交試驗(yàn) 將丹參藥材粗粉裝入萃取釜中,同時(shí)加入夾帶劑,按設(shè)定的工藝參數(shù)進(jìn)行萃取。試驗(yàn)安排及結(jié)果見表2,方差分析結(jié)果見表3。

正交試驗(yàn)結(jié)果表明,影響超臨界CO2萃取丹參酮ⅡA的因素依次為A＞C＞B＞D,最佳工藝條件為A3B1C3D2,即夾帶劑乙醇用量為120 ml,萃取釜壓力為20 MPa,萃取溫度為50℃,分離溫度為35℃。在此條件下對(duì)工藝進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果粗提物中丹參酮ⅡA的量為414.2 mg(n=3),質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3.84%。

表1 正交試驗(yàn)的因素和水平設(shè)計(jì)Table 1 Design of factors and levels of orthogonal test

表2 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)和結(jié)果Table 2 Design and results of orthogonal test

表3 方差分析結(jié)果Table3Results of variance analysis

2.4 分離純化 取超臨界CO2萃取得到的丹參酮ⅡA粗提取物30 g溶于20 ml苯中,加10 g中性氧化鋁拌和均勻,取12 ml混合物裝于中性氧化鋁層析柱(70 cm×4 cm,用中性氧化鋁250 g)上,用苯洗脫,待色帶完全展開后,將氧化鋁緩緩倒出,按其顏色分為紫紅色段、橙紅色段、墨綠色段和暗紅色段。將紫紅色段氧化鋁粉末再裝于層析柱上,進(jìn)一步用苯洗脫,分段收集洗脫液。用丹參酮ⅡA對(duì)照品作為對(duì)照,采用薄層色譜對(duì)流份進(jìn)行跟蹤檢測(cè),收集富含丹參酮ⅡA的流份,減壓回收溶劑,用 20%(V/V)無(wú)水乙醇重結(jié)晶,靜置過(guò)夜,得到紅色針狀結(jié)晶。經(jīng)HPLC法測(cè)得晶體中丹參酮ⅡA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為93.49%。

3 討 論

索氏提取法和乙醇浸提法提取丹參酮ⅡA的主要缺點(diǎn)是提取率低、雜質(zhì)較多、顏色較深,提取耗時(shí)長(zhǎng)、損失大。索氏提取法和乙醇浸提法萃取物中丹參酮的含量分別為16.1%和 18.8%[4]。超臨界CO2萃取的粗提物中丹參酮ⅡA含量明顯提高,但離單體還有很大差距。粗提物經(jīng)柱層析分離后可以得到較高純度丹參酮ⅡA,層析得到的其他各段分離物的成分還有待進(jìn)一步的研究確定。本研究結(jié)果顯示,用超臨界CO2萃取提取丹參酮ⅡA是可行的,與其他方法比較有一定的優(yōu)勢(shì)[5,6],僅用少量安全的常規(guī)溶劑乙醇作夾帶劑即可,并且生產(chǎn)周期短,提取效率高。本研究對(duì)于超臨界CO2萃取丹參酮的工業(yè)化生產(chǎn)具有一定的指導(dǎo)意義。

[1] 沈映君,徐秋萍,陳 奇,等.中藥藥理學(xué)[M].2版.北京:人民衛(wèi)生出版社,2000:661-670.Shen YingJun,Xu QiuPing,Chen Qi,et al.Pharmacology of Chinese materia medica[M].2nd ed.Beijing:People's Health Press,2000:661-670.Chinese.

[2] 張鏡澄.超臨界流體萃取[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2002:4-130.Zhang JingCheng.Supercritical fluid extraction[M].Beijing:Chemical Industrial Press,2002:4-130.Chinese.

[3] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典.2010年版一部[S].北京:中國(guó)醫(yī)藥科技出版社,2010:70-71.State Pharmacopoeia Committee.Pharmacopoeia ofthe People's Republic of China.2010 ed,Volume 1[S].Beijing:Chinese M edical Science Press,2010:70-71.Chinese.

[4] 姚建國(guó),蔣永紅,周卯星,等.超臨界二氧化碳萃取丹參中的丹參酮[J].山西中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,4(1):41-44.Yao JianGuo,Jiang YongHong,Zhou MaoXing,et al.Extraction of tanshinones from the root of Salvia Miltiorrhiza Bge.by supercritical CO2fluid[J].J Shanxi Coll T radit Chin Med,2003,4(1):41-44.Chinese.

[5] 常虹飛,楊 震.正交試驗(yàn)法優(yōu)選超臨界CO2流體萃取丹參中丹參酮工藝的研究[J].河北工業(yè)科技,2008,25(6):352-353.Chang HongFei,Yang Zhen.Study on orthogonal design for optimizing supercritical-CO2fluid ex traction technique of tanshinones from radix salviae[J].Hebei J Ind Sci Tech,2008,25(6):352-353.Chinese with abstract in English.

[6] 李東穎,牟宏晶,丁為民.均勻設(shè)計(jì)法優(yōu)化丹參酮ⅡA的超臨界二氧化碳萃取工藝[J].哈爾濱理工大學(xué)學(xué)報(bào),2008,13(2):100-102.Li Dong Ying,M ou HongJing,Ding WeiMin.Optimization of the ex traction of tanshinoneⅡAby supercritical CO2using uniform desig n[J].J Harbin Univ Sci T ech,2008,13(2):100-102.Chinese with abstract in English.