在Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)中表達(dá)毒蕈堿型M2及M5受體重組突變體

牟 男，孫洪良，鄭建全，王麗韞

(軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所軍事毒理及生化藥理室，北京 100850)

毒蕈堿(muscarine，M)型乙酰膽堿受體屬于A類(lèi)G蛋白耦聯(lián)受體家族，具有7次跨膜結(jié)構(gòu)，包括M1～M55種亞型，廣泛分布于外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)，參與多種生理功能的調(diào)控，包括血壓、心率以及認(rèn)知和記憶等復(fù)雜的生理活動(dòng)。多年來(lái)，盡管M受體作為藥物研究的一個(gè)重要靶標(biāo)在重大疾病研究領(lǐng)域中的意義已為大家所認(rèn)同［1－4］，但5種受體亞型分布各異且功能各不相同，而且激動(dòng)劑結(jié)合位點(diǎn)結(jié)構(gòu)高度保守，導(dǎo)致M受體藥物的亞型選擇性差，臨床上用藥易出現(xiàn)明顯的不良反應(yīng)，導(dǎo)致作用于M受體系統(tǒng)的藥物尤其亞型選擇性新藥的研究進(jìn)展緩慢［5－6］。近來(lái)的研究表明，M 受體具有變構(gòu)調(diào)節(jié)特性，變構(gòu)調(diào)節(jié)是指變構(gòu)調(diào)節(jié)劑激活變構(gòu)位點(diǎn)(功能位點(diǎn)以外的特異性結(jié)合位點(diǎn))，通過(guò)易化(正性調(diào)節(jié))或抑制(負(fù)性調(diào)節(jié))受體功能位點(diǎn)的空間結(jié)構(gòu)，起到調(diào)節(jié)其生物學(xué)功能的作用。M受體的5種受體亞型都存在著變構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制，這提示變構(gòu)調(diào)位點(diǎn)低保守性可能是開(kāi)發(fā)具有M受體亞型選擇藥物一個(gè)新的研究途徑。研究表明，在5種M受體亞型中，M2受體亞型對(duì)變構(gòu)調(diào)節(jié)最為敏感，M5受體亞型最不敏感。因此，建立M2與M5嵌合表達(dá)受體將為變構(gòu)調(diào)節(jié)劑及作用位點(diǎn)的研究奠定可靠的理論基礎(chǔ)［7－9］。本研究以 M2和 M5為靶標(biāo)，分別構(gòu)建 M2及M5受體亞型的突變重組體，旨在為M受體亞型特異性的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑及基因工程的研究提供一個(gè)理想的平臺(tái)。

桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)是近年應(yīng)用廣泛的真核表達(dá)系統(tǒng)，它具有真核表達(dá)系統(tǒng)的翻譯后加工功能、表達(dá)水平高、蛋白產(chǎn)物有天然蛋白特性以及能同時(shí)表達(dá)多個(gè)外源基因等特點(diǎn)［10－11］，同時(shí)該表達(dá)系統(tǒng)還能提供大量的蛋白，能夠滿(mǎn)足蛋白結(jié)構(gòu)和高通量藥物篩選等新方法技術(shù)研究的需求。本研究擬建立M2和M5受體亞型的突變表達(dá)株、點(diǎn)突變細(xì)胞株及M受體亞型相應(yīng)結(jié)構(gòu)域的蛋白表達(dá)系統(tǒng)(桿狀病毒/Sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng))，為亞型選擇型變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的研究提供技術(shù)平臺(tái)。

1 材料與方法

1.1 試劑

質(zhì)粒、菌株及細(xì)胞 E.coli DH5α，JM109和M2/M5-pcDNA3.1+DNA購(gòu)自美國(guó) Guthrie cDNA Resource Center，Sf9細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院協(xié)和醫(yī)科大學(xué)，DNA純化試劑盒Wizard Plus SV Minipreps DNA Purification System，轉(zhuǎn)染試劑 Cellfectin Invitrogen，限制性?xún)?nèi)切酶均購(gòu)自日本TaKaRa公司。Bluo-gal IPTG，GIBCO Grace昆蟲(chóng)培養(yǎng)基，Bac-to-Bac?桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，GIBCO胎牛血清，sf-900ⅡSFM昆蟲(chóng)培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司。［3H］N-甲基-東莨菪堿(N-methyl-［3H］scopolamine，［3H］NMS)購(gòu)自英國(guó)Amersham公司。

1.2 M2和M5受體重組基因的構(gòu)建

1.2.1 M2和M5受體重組基因突變?cè)O(shè)計(jì)原則

根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］將野生M2型及M5受體進(jìn)行以下突變，突變?cè)O(shè)計(jì)如下:① 將N-糖基化位點(diǎn)Asp突變?yōu)锳sn，以保證在表達(dá)后能獲得結(jié)構(gòu)均一的蛋白，因?yàn)楫愒幢磉_(dá)可能導(dǎo)致在不同的部位發(fā)生糖基化而影響蛋白的結(jié)構(gòu)。②為了避免重組受體在昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒系統(tǒng)中被蛋白酶降解，刪除了M受體的第3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)，這是G蛋白結(jié)合識(shí)別部位，對(duì)于配體的識(shí)別部位沒(méi)有影響，刪除M2受體233～380氨基酸序列，刪除M5受體246～431氨基酸序列。③為了方便表達(dá)后的檢測(cè)以及純化工作，在C端添加了凝血酶識(shí)別位點(diǎn)和6-組氨酸(6-histamine，6-His)標(biāo)記，設(shè)計(jì)思路見(jiàn)圖1。

圖1 突變毒蕈堿(M)受體結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)原則.A:N端糖基化位點(diǎn)Asp突變?yōu)锳sn;B.刪除M受體的第3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán);C.在C端添加了凝血酶識(shí)別位點(diǎn)和6-His標(biāo)簽.Fig.1 Mutation site designed in the muscarinic(M)receptor.

1.2.2 PCR突變過(guò)程及所用引物

使用M2/M5-pcDNA3.1+DNA為PCR模板，分為三步PCR:第一步使用兩組引物1和引物2，引物3和引物4，引物1的序列將糖基化位點(diǎn)Asp突變成Asn，引物2由編碼第5個(gè)跨膜區(qū)胞內(nèi)部分序列和第6跨膜區(qū)胞內(nèi)部分的核酸序列共同組成，引物3是其核苷酸序列與引物2序列完全互補(bǔ)，但5'端、3'端走向與之相反的正向引物，引物4為M2/M5羧基端序列。第二步以第一步的2個(gè)PCR產(chǎn)物為模板，使用引物1和引物4進(jìn)行PCR，獲得的產(chǎn)物為成功刪除了第3個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)的DNA序列;第三步PCR以第二步的產(chǎn)物為模板，使用引物1和引物5進(jìn)行PCR，引物5加入了凝血酶切位點(diǎn)及6-His標(biāo)簽序列，具體過(guò)程見(jiàn)示意圖2。獲得具有突變序列的所有PCR產(chǎn)物均進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序工作均由北京博邁德生物有限公司完成。

圖2 三步PCR法突變過(guò)程.步驟1:將糖基化位點(diǎn)Asp突變成Asn;步驟2:刪除了第三個(gè)細(xì)胞內(nèi)環(huán)的DNA序列;步驟3:加入了凝血酶切位點(diǎn)及6-His標(biāo)簽序列.Fig.2 Mutation performed by three-step PCR.

M2受體突變所用引物:正向引物P1:GCGAATTCATGGATGATTCAACAGATTCCTCTGATAATAGCCTGGCTC;反向引物P2:TGGTTCTGGGGCAAAGA-GGTGCCCTTTTCTTTCAGTGGTCCTGT;正向引物P3:ACCAAGACCCCGTTTCTCCACGGGAAAAGAAAGTCACCAGGACA;反向引物P4:TTGTATCCGCGATGTTCCGACCAAGGCGCACCATCACTAATGGTA;反向引物P5:CGCACCATCACTAATGGTAGTGGTAGTGGTAGTGTTAGATCTCG。M5受體突變所用引物:正向引物 P1:GCGAATTCATGGAAGGGGATTCTTACCACGATGCAACCACCGTCGATGGC;反向引物P2:CTCTCTTTGACTAGGACCACAGCTGGCTTTCTCTTCTCAG;正向引物P3:CTGAGAAGAGAAAGCCAGCTGTGGTCCTAGTCAAAGAGAG;反向引物P4:GTAATCACTACCACGCGGAACCAGGGGTAGCTTGCTGTTCCCCT;反向引物 P5:GCTCTAGATTAGTGATGGTGATGGTGATGGTAATCACTACCACGCGGAAC。

1.2.3 PCR 反應(yīng)體系及條件

50 μl PCR 反應(yīng)體系含有 1 μl DNA 模板，5 μl引物混合物(10 pmol·L－1)，1 μl 10 ×PCR 緩沖液，1 μl dNTP(10 mmol·L－1)，1 μl Taq 聚合酶(2.5 U)，PCR反應(yīng)參數(shù)為95℃變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火 45 s，72℃45 s，30 ～35 循環(huán)，72℃ 延伸 7 min。樣品在100 V電壓條件下，上樣于含有溴化乙錠500 mg·L－1的0.7%瓊脂糖凝膠中電泳約90 min。

1.3 基因克隆質(zhì)粒提取、酶切、連接、轉(zhuǎn)化和克隆鑒定［13］

將目的DNA經(jīng)特異性?xún)?nèi)切酶EcoRⅠ酶切后連接至pfastbac1質(zhì)粒載體，轉(zhuǎn)化DH10BacTM菌株，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取白斑，經(jīng)培養(yǎng)、提取質(zhì)粒。使用pUC/M13的擴(kuò)增引物通過(guò)PCR的方法分析產(chǎn)物的長(zhǎng)度來(lái)達(dá)到檢驗(yàn)片段是否成功插入。

1.4 昆蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)

在昆蟲(chóng)細(xì)胞培養(yǎng)基Sf-900Ⅱ，培養(yǎng)基中增加青霉素50 kU·L－1和鏈霉素 50 mg·L－1，在無(wú) CO2的條件下，27℃生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)Sf9細(xì)胞。當(dāng)Sf9細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，使用Sf-900ⅡSFM無(wú)血清昆蟲(chóng)培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，完全培養(yǎng)基濃度按80%，60%，40%，20%和0%馴化培養(yǎng)Sf9細(xì)胞，每個(gè)濃度至少培養(yǎng)細(xì)胞3代至穩(wěn)定，直至完全適合Sf-900ⅡSFM的生長(zhǎng)。

1.5 重組桿粒DNA轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞及收獲重組桿狀病毒

使用轉(zhuǎn)染試劑盒，按說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，即用線性化病毒DNA轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，由于Sf9細(xì)胞的倍增時(shí)間是3 d，因此轉(zhuǎn)染細(xì)胞應(yīng)在細(xì)胞種植后的第3天進(jìn)行。置27℃培養(yǎng)4～5 d，每天觀察細(xì)胞病變并與正常細(xì)胞對(duì)照。從轉(zhuǎn)染物中收獲病毒時(shí)，上清通過(guò)離心澄清，用于滴定/擴(kuò)增。連續(xù)感染傳代，通過(guò)噬斑純化得到重組病毒，并進(jìn)一步用PCR進(jìn)行鑒定。利用單細(xì)胞層培養(yǎng)物形成的空斑數(shù)量來(lái)確定桿狀病毒上清的滴度，使用中性紅凝膠染色計(jì)數(shù)空斑數(shù)量〔滴度(pfu/ml)=1/稀釋倍數(shù)×空斑數(shù)×1/接種量(ml)〕。

1.6 表達(dá)產(chǎn)物的初步純化及Western印跡法確定目的基因的表達(dá)

將收集轉(zhuǎn)染72 h的昆蟲(chóng)細(xì)胞，及擴(kuò)大培養(yǎng)的病毒上清，先干燥濃縮，然后用適當(dāng)體積的Tris-HCl 20 mmol·L－1pH 7.5 稀釋?zhuān)^(guò) QiagenNi-NTA Superflow Cartridge螯合柱進(jìn)行親和純化，具體實(shí)驗(yàn)步驟參考試劑盒說(shuō)明書(shū)。BSA法測(cè)定純化的蛋白濃度，加入5×SDS電泳加樣緩沖液后，100℃，煮沸5 min變性。12%SDS-PAGE進(jìn)行蛋白電泳，抗6his-tag的鼠單抗(1∶2000)，4℃過(guò)夜孵育，檢測(cè)蛋白是否表達(dá)成功。

1.7 放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析重組受體的親和活性

將轉(zhuǎn)染72 h的昆蟲(chóng)細(xì)胞收集，加入Na+/K+PBS 5 mmol·L－1(Na2HPO44 mmol·L－1，KH2PO41 mmol·L－1，pH 7.4)制成勻漿，2000 × g 離心，膜蛋白重懸于 PB 緩沖液5 mmol·L－1，用 Lowry 等［14］法測(cè)定蛋白濃度后，進(jìn)行［3H］NMS飽和實(shí)驗(yàn)，采用0.5 ml的反應(yīng)體系，將蛋白勻漿 0.1 g·L－1(每管 20 μg)與［3H］NMS 0.05，0.1，0.125，0.5，1 和 2 nmol·L－1)混合，37℃孵育30 min;競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合實(shí)驗(yàn)中，將蛋白勻漿(每管50 μg)，37℃共同孵育30 min(均為復(fù)管，重復(fù)3 次)。用冰冷的緩沖液(Na+/K+PBS 50 mmol·L－1，pH 7.4)3 ml終止反應(yīng)，用多孔細(xì)胞樣品收集器經(jīng)GF/C玻璃纖維濾紙抽濾，緩沖液沖洗3次，晾干后置于閃爍杯中，加入閃爍液3 ml，放置過(guò)夜，液閃計(jì)數(shù)儀(效率為40% ～50%)進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 M2及M5受體重組基因擴(kuò)增產(chǎn)物鑒定

搭橋PCR結(jié)果表明，成功擴(kuò)增出M2受體亞型核酸序列起始密碼子至第3個(gè)細(xì)胞內(nèi)端之間核酸序列及第六跨膜區(qū)至終止密碼子之間序列共長(zhǎng)1018 bp的重組M2受體核酸序列(圖3)。以及M5受體亞型核酸序列起始密碼子至第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)之間核酸序列及第六跨膜區(qū)至終止密碼子間序列共長(zhǎng)期實(shí)踐1041 bp重組M5受體核酸序列(圖4)。

圖3 搭橋PCR法擴(kuò)增野生型M2基因片段.M:DNA標(biāo)志物;條帶1:重組M2受體全長(zhǎng)序列(1018 bp);條帶2:啟動(dòng)子與第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)序列(731 bp);條帶3:第6個(gè)跨膜區(qū)與終止密碼子間序列 (287 bp).Fig.3 Amplification of recombinant gene fragments of wild M2receptor by overlap PCR.

圖4 搭橋PCR法擴(kuò)增野生型重組M5受體基因片段.M:DNA標(biāo)志物;條帶1:重組M5受體全長(zhǎng)序列(1018 bp);條帶2:啟動(dòng)密碼子與第3個(gè)胞內(nèi)環(huán)序列(738 bp);條帶3:第6個(gè)跨膜區(qū)與終止密碼子間序列(303 bp).Fig.4 Amplification of recombinant gene fragments of wild M5by overlap PCR.

2.2 M2/M5重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物和pfastbac1質(zhì)粒使用EcoRⅠ/XbaⅠ酶切后回收片段，隨后進(jìn)行連接，然后再將重組載體擴(kuò)增，通過(guò)質(zhì)粒抽提獲得兩個(gè)重組的pfastbac1質(zhì)粒，質(zhì)粒示意圖見(jiàn)圖5A，轉(zhuǎn)化DH10BacTM菌株，通過(guò)藍(lán)白斑篩選挑取白斑，經(jīng)培養(yǎng)、提取質(zhì)粒。由于桿狀病毒基因組DNA＞135 kb，使用pUC/M13的擴(kuò)增引物通過(guò)PCR的方法分析產(chǎn)物的長(zhǎng)度來(lái)達(dá)到檢驗(yàn)片段是否成功插入的方法?；蚪MDNA本身的attTn7靶位之間的序列只有約為300 bp，因此成功的插入將會(huì)使對(duì)attTn7靶位之間的PCR產(chǎn)物增大，M2和M5的PCR產(chǎn)物應(yīng)分布為1318 bp和1341 bp的基因片段，為此設(shè)計(jì)兩條引物用來(lái)擴(kuò)增 attTn7靶位之間的片段:正向引物，GTTTTCCCAGTCACGAC;反向引物，CAGGAAACAGCTATGAC。PCR結(jié)果證實(shí)插入片段方向及與載體大小均正確。這表明重組轉(zhuǎn)移載體，即M2/M5重組轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建成功(圖5B)。

2.3 轉(zhuǎn)染前細(xì)胞無(wú)血清培養(yǎng)馴化及條件優(yōu)化對(duì)細(xì)胞增殖的影響

圖5 pfastbac1/M2(M5)重組質(zhì)粒圖譜(A)及瓊脂糖凝膠電泳分析(B).條帶1:重組M2基因片段;條帶2:重組M5基因片段;條帶3:空白對(duì)照組.Fig.5 Map of recombinant plasmid pfastbac1/M2(M5)(A)and agarose gel electrophoresis(B).

為了使細(xì)胞適合懸浮培養(yǎng)及不影響胞外分泌蛋白的表達(dá)和純化工作，對(duì)Sf9細(xì)胞需要進(jìn)行無(wú)血清馴化培養(yǎng)，本實(shí)驗(yàn)按照80%，60%，40%，20%和0%依次遞減Sf-900ⅡSFM完全培養(yǎng)基中血清濃度，每個(gè)濃度至少馴化培養(yǎng)細(xì)胞3代至穩(wěn)定，圖6顯示為在血清濃度分別為80%，40%，20%和0%馴化培養(yǎng)條件下，細(xì)胞增殖周期的變化，橫坐標(biāo)為馴化培養(yǎng)Sf9細(xì)胞生長(zhǎng)時(shí)間段，縱坐標(biāo)對(duì)應(yīng)時(shí)間段細(xì)胞數(shù)目。從圖中可以看出，血清剛開(kāi)始遞減，在含血清80%，40%培養(yǎng)條件下，細(xì)胞生長(zhǎng)明顯減慢，培養(yǎng)96 h后進(jìn)入增殖期，當(dāng)Sf9細(xì)胞完全適合了無(wú)血清Sf-900ⅡSFM的培養(yǎng)條件后，在同樣接種密度條件下，細(xì)胞在生長(zhǎng)至72 h進(jìn)入增殖期，而且繼續(xù)培養(yǎng)150～160 h，單位體積內(nèi)細(xì)胞數(shù)量顯著增加(7～8)×1011L－1，而剛開(kāi)始接受馴化的細(xì)胞(80%或40%)，受血清濃度的影響大，最大細(xì)胞密度僅為3×108L－1(n=3，P ＜0.01)。

圖6 昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞在不同血清濃度中的馴化培養(yǎng).錐蟲(chóng)(臺(tái)盼)藍(lán)染色確定細(xì)胞活性.±s，n=3.＊＊P＜0.01，與含80%血清組比較.Fig.6 Domesticated cultivation of Sf9 cell in the medium with different concentrations of serum.

2.4 M2及M5重組桿狀病毒的獲得

重組載體質(zhì)粒與線性化病毒DNA共轉(zhuǎn)染昆蟲(chóng)細(xì)胞Sf9，經(jīng)噬斑篩選和數(shù)代培養(yǎng)，得到重組桿狀病毒。將其感染昆蟲(chóng)細(xì)胞后可見(jiàn)細(xì)胞病變(圖7A)，而正常對(duì)照細(xì)胞則無(wú)這種變化(圖7B)。

圖7 轉(zhuǎn)染重組M2/M5病毒顆粒后Sf9細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化.A:正常昆蟲(chóng)Sf9細(xì)胞;B:轉(zhuǎn)染重組M2/M5病毒顆粒后sf9細(xì)胞.Fig.7 Morphologic changes of Sf9 with or without transfection with recombinant M2/M5virus-like particles.

2.5 M2及M5重組蛋白的表達(dá)

重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞72 h后，過(guò)QiagenNi-NTA Superflow Cartridge螯合柱進(jìn)行親和純化，獲得重組M2/M5蛋白。經(jīng)Western印跡分析，在相對(duì)分子質(zhì)量為(3.5～3.8)×103處出現(xiàn)蛋白帶(圖8)。經(jīng)蛋白定量測(cè)得昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)的目的蛋白量約為10 g·L－1培養(yǎng)上清，回收率可達(dá)1/3～1/2(3 ～5 g·L－1培養(yǎng)液)。

圖8 Western印跡法檢定Sf9細(xì)胞中M2和M5受體表達(dá).條帶1:重組M2受體(319氨基酸);條帶2:重組M5受體(347氨基酸);條帶3:空載體轉(zhuǎn)染對(duì)照組.Fig.8 Expression of recombinant of M2and M5receptor in Sf9 cell detected by Western blotting.

2.6 表達(dá)的M2及M5重組蛋白受體的親和力

圖9結(jié)果表明，重組表達(dá)的M2及M5受體蛋白20 μg與［3H］NMS共同孵育，結(jié)合計(jì)數(shù)表明該均重組表達(dá)的M2及M5受體蛋白與［3H］NMS具有特異性的結(jié)合能力，增加［3H］NMS的濃度，特異性結(jié)合增加，存在著明顯的量效關(guān)系，表明該M2/M5重組受體蛋白具有M受體功能位點(diǎn)的特異性結(jié)構(gòu)特征。而空載體感染對(duì)照組粗提膜蛋白沒(méi)有與［3H］NMS的特異性結(jié)合，提示本實(shí)驗(yàn)利用sf9昆蟲(chóng)細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)成功表達(dá)了M2/M5受體蛋白質(zhì)。

圖9 放射性配體受體飽和實(shí)驗(yàn)分析［3H］N-甲基-東莨菪堿(［3H］NMS)與Sf9細(xì)胞構(gòu)建表達(dá)的M2和M5受體的親和力.轉(zhuǎn)染72 h的Sf9細(xì)胞，制備膜蛋白，每管含蛋白20 μg，與［3H］NMS，37℃共同孵育30 min.放射液閃計(jì)數(shù)測(cè)定受體與［3H］NMS的結(jié)合.±s，n=3.Fig.9 Binding affinity of［3H］N-methyl［3H］scopolamine(［3H］NMS)to recombinant M2and M5muscarinic receptors expressed on Sf9 cell.

3 討論

本研究根據(jù)M受體存在變構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制，變構(gòu)位點(diǎn)低保守，利用Sf9-桿狀病毒作為表達(dá)體系，使用分子生物學(xué)技術(shù)建立用于M受體變構(gòu)調(diào)節(jié)劑研究的平臺(tái)。根據(jù)參考文獻(xiàn)［12］，M受體的功能位點(diǎn)位于跨膜區(qū)，而變構(gòu)位點(diǎn)位于功能位點(diǎn)的入口處，與其毗鄰，主要在細(xì)胞外側(cè)面的三個(gè)細(xì)胞外環(huán)，為減少影響表達(dá)的其他因素，本研究在克隆M2和M5受體亞型基因時(shí)，通過(guò)RT-PCR方法分別將人野生型M2，M5基因成功作如下突變:①將N-糖基化位點(diǎn)Asp突變?yōu)锳sn;② 刪除了M2受體233～380氨基酸序列，M5受體246～431氨基酸序列被刪除;③ 兩個(gè)受體亞型C端添加了凝血酶識(shí)別位點(diǎn)(CMV)和6-His標(biāo)簽。通過(guò)搭橋PCR的方法，采用具有互補(bǔ)末端的搭橋引物，使PCR產(chǎn)物形成了重疊鏈，從而在隨后的擴(kuò)增反應(yīng)中通過(guò)重疊鏈的延伸，將M受體不同來(lái)源的擴(kuò)增片段拼接起來(lái)，獲得我們需要的全序列目的基因片段，進(jìn)而建立了適合在Sf9-桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)的M2/M5的重組野生型載體Bacmid，并轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞使蛋白得以表達(dá)，建立M受體野生型桿狀病毒/Sf9昆蟲(chóng)表達(dá)系統(tǒng)。

具體操作時(shí)，最關(guān)鍵的步驟是重組病毒的篩選，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)藍(lán)白篩選后的重組病毒，尚存在假陽(yáng)性的可能，為了進(jìn)一步確證外源基因的重組，本研究運(yùn)用PCR方法分析重組Bacmid基因組，證明確已獲得插有目的基因片段的重組病毒。將重組桿狀病毒感染昆蟲(chóng)細(xì)胞72 h后可見(jiàn)細(xì)胞明顯變大變圓，而正常對(duì)照細(xì)胞則無(wú)這種變化。采用親和層析/凝膠色譜層析等方法提取純化蛋白，將純化蛋白進(jìn)行電泳分析證明M2/M5野生突變基因經(jīng)過(guò)重組并在昆蟲(chóng)細(xì)胞中獲得了表達(dá)。經(jīng)蛋白定量測(cè)得昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)目的蛋白的量約為10 g·L－1培養(yǎng)上清，回收率3～5 g·L－1培養(yǎng)液。但這種昆蟲(chóng)細(xì)胞能否對(duì)M2和M5的受體前肽分子進(jìn)行正確加工剪切，并形成具有成熟空間結(jié)構(gòu)的受體形式還不清楚。為此，選用M受體非特異性拮抗劑［3H］NMS作為標(biāo)記配體，經(jīng)放射性配體受體結(jié)合實(shí)驗(yàn)，分析表達(dá)受體與［3H］NMS的結(jié)合能力，確定野生突變重組表達(dá)蛋白的特異性結(jié)合特征，結(jié)果表明該系統(tǒng)表達(dá)的兩種受體蛋白均具有與［3H］NMS特異性的親和性，特異性結(jié)合隨著標(biāo)記配體濃度增加而增加，進(jìn)一步證明該突變的野生型M受體在昆蟲(chóng)細(xì)胞表達(dá)體系中正確表達(dá)，為后續(xù)研究建立突變重組受體、點(diǎn)突變受體，探討作用于M受體的新型變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的構(gòu)效機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

本研究成功構(gòu)建了M2及M5受體亞型野生突變重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)，為進(jìn)一步構(gòu)建M2/M5嵌插受體亞型野生突變重組桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)和有關(guān)作用于M受體變構(gòu)位點(diǎn)藥物的篩選及機(jī)制研究建立藥物平臺(tái)。

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