異氟烷對(duì)幼小鼠自主活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶行為的影響

張科學(xué)，趙佳佳，張慶華，權(quán) 全，王曉健，李華超，林潔榮，蔡慧明，劉 蘇，戴體俊

(徐州醫(yī)學(xué)院1.麻醉學(xué)院，2.麻醉藥理學(xué)教研室，江蘇徐州 221002)

學(xué)習(xí)和記憶是動(dòng)物和人類賴以生存所不可缺少的腦功能，動(dòng)物的自主活動(dòng)情況反映其中樞神經(jīng)系統(tǒng)的功能狀態(tài)［1］。嬰幼兒階段是人腦發(fā)育成熟的關(guān)鍵時(shí)期，在此期間使用異氟烷(isoflurane，Iso)是否損傷中樞神經(jīng)系統(tǒng)尚無(wú)明確結(jié)論。有研究表明，Iso可促進(jìn)新生大鼠腦內(nèi)廣泛區(qū)域神經(jīng)細(xì)胞凋亡，影響其成年后的學(xué)習(xí)記憶功能［2］，但I(xiàn)so對(duì)于大于新生階段的幼鼠自主活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶的影響未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以幼小鼠為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，采用跳臺(tái)和避暗法觀察Iso對(duì)幼小鼠學(xué)習(xí)記憶作用，觀察不同劑量Iso對(duì)小鼠自主活動(dòng)計(jì)數(shù)的影響，并用能透過(guò)血腦屏障的 γ-氨基丁酸 A(γ-aminobutyric acid，GABAA)受體特異性阻斷劑一葉萩堿(securinine，Sec)探討其與GABAA受體關(guān)系，為臨床合理選擇麻醉方案提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

Iso由魯南貝特制藥有限公司生產(chǎn)，批號(hào):080900;硝酸Sec注射液由北京市永康藥業(yè)有限公司生產(chǎn)，批號(hào):090731，規(guī)格:每支2 ml(8 mg);YLS-1A多功能小鼠自主活動(dòng)記錄儀，安徽淮北正華生物儀器有限公司;DT2200跳臺(tái)儀和BA2200小鼠避暗儀，成都泰盟科技有限公司產(chǎn)品。

1.2 動(dòng)物及分組

昆明種幼小鼠360只，由徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào) SCXK(蘇)2010-0003，9～10 d齡，體質(zhì)量8～13 g。實(shí)驗(yàn)前2 d使小鼠熟悉實(shí)驗(yàn)室環(huán)境，自由飲食、攝水，為避免小鼠各個(gè)時(shí)間段可能出現(xiàn)行為差異影響研究結(jié)果，實(shí)驗(yàn)于每日同一時(shí)間段進(jìn)行。

每個(gè)實(shí)驗(yàn)的所有動(dòng)物按分層隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)分為正常對(duì)照組，Iso 0.05，0.1 和0.2 ml·kg－1組，Sec 2，4 和 8 mg·kg－1組，Iso 0.2 ml·kg－1+Sec 2，4 和 8 mg·kg－1組，每組分別sc給予相應(yīng)劑量的生理鹽水(正常對(duì)照)或Sec，10 min后ip給予Iso。

1.3 自主活動(dòng)儀檢測(cè)小鼠自主活動(dòng)

記錄儀測(cè)試用藥后15，30，45和60 min小鼠5 min內(nèi)活動(dòng)次數(shù)。

1.4 避暗實(shí)驗(yàn)

訓(xùn)練時(shí)，先將各組小鼠放入反應(yīng)箱中，適應(yīng)環(huán)境3 min，然后取出。向暗室底部銅柵通36 V，50 Hz交流電，再將小鼠背對(duì)洞口放入明室，小鼠進(jìn)入暗室則受到電擊。24 h后重復(fù)實(shí)驗(yàn)，記錄小鼠第1次進(jìn)入暗室的時(shí)間(步入潛伏期)和5 min內(nèi)受到的電擊次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。若小鼠5 min未進(jìn)入暗室，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為300 s。

1.5 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)

各組小鼠放入反應(yīng)箱內(nèi)適應(yīng)環(huán)境3 min，然后以36 V，50 Hz交流電給予電擊。小鼠受電擊，正常反應(yīng)是跳回平臺(tái)以躲避傷害性刺激。多數(shù)小鼠可能再次或多次跳至銅柵上，受到電擊后又迅速跳回平臺(tái)，如此訓(xùn)練5 min，24 h后重做測(cè)驗(yàn)。記錄小鼠第1次跳下平臺(tái)的潛伏期和3 min內(nèi)受到電擊的次數(shù)(錯(cuò)誤次數(shù))。若小鼠3 min未跳下平臺(tái)，錯(cuò)誤次數(shù)記為0次，潛伏期記為180 s。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 異氟烷對(duì)幼小鼠自主活動(dòng)的影響

表1結(jié)果顯示，正常對(duì)照組小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)在4個(gè)測(cè)試時(shí)間點(diǎn)逐漸減少，60 min時(shí)5 min內(nèi)的自主活動(dòng)次數(shù)為45±35。與同一時(shí)間點(diǎn)的正常對(duì)照組相比，Iso 0.05，0.1 和 0.2 ml·kg－1組(除 Iso 0.05在60 min時(shí))小鼠自主活動(dòng)次數(shù)均明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。Sec 2和4 mg·kg－1對(duì)小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)無(wú)影響，但Sec 8 mg·kg－1在用藥后15 min小鼠自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少，并有2只小鼠出現(xiàn)驚厥，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05)。與同一時(shí)間單用 Iso 0.2 ml·kg－1組相比，Sec 2，4 和 8 mg·kg－1在 15 min 時(shí)、Sec 4 mg·kg－1在30 min 時(shí)和 Sec 2 mg·kg－1在 45 min 時(shí)自主活動(dòng)次數(shù)明顯增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，P＜0.01);但與同一時(shí)間正常對(duì)照組比較，合用 Sec 2 mg·kg－1組在 15 min，Sec 4 mg·kg－1在 15和60 min以及Sec 8 mg·kg－1在4個(gè)測(cè)試點(diǎn)時(shí)自主活動(dòng)次數(shù)明顯減少差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)。

2.2 異氟烷對(duì)幼小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響

表2結(jié)果顯示，避暗實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，給藥后 1 d，Iso 0.1 和 0.2 ml·kg－1組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加和潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，Iso 0.05 ml·kg－1組錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。Sec 2，4和8 mg·kg－1組在給藥后1 d和2 d，錯(cuò)誤次數(shù)與潛伏期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與各相應(yīng)時(shí)間單用Iso 0.2 ml·kg－1組相比，給藥后 1 d，Sec 2，4 和 8 mg·kg－1組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少，潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01);但與正常對(duì)照組比較，給藥后1 d和2 d，Iso+Sec 2 mg·kg－1組潛伏期顯著縮短，錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)。

表1 異氟烷(Iso)對(duì)幼小鼠自主活動(dòng)的影響Tab.1 Effects of isoflurane(Iso)on spontaneous motor activity in juvenile mice

表2 避暗實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Iso對(duì)幼小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Tab.2 Effects of Iso on latency and error times of juvenile mice in step through test

表3結(jié)果顯示，在跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)中，與正常對(duì)照組相比，給藥后1 d，Iso 0.1 和 0.2 ml·kg－1組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著增加和潛伏期顯著縮短，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01);給藥后1 d和2 d，Sec 2，4和8 mg·kg－1組錯(cuò)誤次數(shù)與潛伏期差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;與各相應(yīng)時(shí)間單用 Iso 0.2 ml·kg－1組相比，給藥后1 d，合用組 Sec 4和8 mg·kg－1組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少、潛伏期顯著延長(zhǎng)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0.05，P ＜0.01)，Sec 2 mg·kg－1組小鼠錯(cuò)誤次數(shù)顯著減少(P ＜0.05)。

表3 跳臺(tái)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Iso對(duì)幼小鼠學(xué)習(xí)記憶的影響Tab.3 Effects of Iso on latency and error times of juvenile mice in step down test

3 討論

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，Iso在用藥后1d可降低幼小鼠自主活動(dòng)次數(shù)，損害學(xué)習(xí)記憶能力，但2 d后以上作用消失，可能是藥物經(jīng)過(guò)5個(gè)半衰期已被基本消除之故，提示Iso對(duì)于幼兒并未造成長(zhǎng)期的神經(jīng)損害。

目前普遍認(rèn)為，Iso是通過(guò)多種機(jī)制發(fā)揮全麻作用的，其中GABAA受體被認(rèn)為是Iso最重要的作用靶位［3－4］，在記憶的形成中主要發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用［5］。Sec和荷包牡丹堿(bicuculline)為 GABAA受體的競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑，可減弱或阻斷GABAA受體介導(dǎo)的抑制效應(yīng)［6］，Sec能夠透過(guò)血腦屏障，故可采用sc給藥，而荷包牡丹堿不易透過(guò)血腦屏障，故未采用。Sec是大戟科植物葉底珠〔Securinega suffruticosa(Pall.)Rehd.〕嫩枝葉或根的主要生物堿［7］。該生物堿最早由原蘇聯(lián)學(xué)者從俄羅斯烏蘇里地區(qū)植物中分離獲得，但其化學(xué)結(jié)構(gòu)卻是由我國(guó)學(xué)者從本土資源提取分離并最終確定。Beutler等［8］發(fā)現(xiàn)Sec具有拮抗GABA受體的作用，對(duì)另一種中樞抑制性遞質(zhì)甘氨酸無(wú)影響，認(rèn)為Sec是哺乳類動(dòng)物中樞神經(jīng)元GABA受體識(shí)別部位的選擇性拮抗劑，我國(guó)學(xué)者也證明了其與GABA受體呈現(xiàn)特異性結(jié)合，IC50為0.1 mmol·L－1［9］。

本實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)給予Sec，小鼠未出現(xiàn)明顯的活動(dòng)異常和遺忘現(xiàn)象，但卻明顯改善了Iso后小鼠的自主活動(dòng)和記憶功能，提示激動(dòng)GABAA受體，可能是Iso影響幼小鼠自主活動(dòng)和學(xué)習(xí)記憶行為的重要機(jī)制之一，Iso可能通過(guò)激動(dòng)GABAA受體而抑制突觸傳遞的長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)效應(yīng)，產(chǎn)生遺忘作用［6］和影響自主活動(dòng)。許多離體實(shí)驗(yàn)的研究表明，吸入全麻藥可增加 GABAA受體介導(dǎo)的 Cl－內(nèi)流，Hall等［10］證實(shí)Iso可增強(qiáng)小鼠小腦浦肯野神經(jīng)元GABA激活的Cl－內(nèi)流。Iso可能通過(guò)與GABAA受體結(jié)合后Cl－通道開放的頻率增加，使神經(jīng)細(xì)胞超極化，從而產(chǎn)生突觸前和突觸后抑制而發(fā)揮其作用。Werner等［11］證實(shí)，吸入麻醉藥的麻醉作用與GABAA受體有關(guān)，李程程［12］、王丹等［13］采用 icv注射荷包牡丹堿證實(shí)GABAA受體介導(dǎo)了全麻藥丙泊酚、依托咪酯的損害學(xué)習(xí)記憶作用，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)sc給予Sec證實(shí)GABAA受體可能部分參與了Iso的損害幼小鼠學(xué)習(xí)記憶作用，與以上研究結(jié)論相一致。實(shí)驗(yàn)中單獨(dú)sc給予Sec 8 mg·kg－1后15 min小鼠的自主活動(dòng)次數(shù)減少，此效應(yīng)可能與Sec用量高引起強(qiáng)直性驚厥［14］有關(guān)，具體機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。

［1］ 涂人順，張國(guó)璽，孫斌輝.關(guān)于小鼠自主活動(dòng)規(guī)律的研究［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2002，18(4):464-465.

［2］ Jevtovic-Todorovic V，Hartman RE，Izumi Y，Benshoff ND，Dikranian K，Zorumski CF，et al.Early exposure to common anesthetic agents causes widespread neurodegeneration in the developing rat brain and persistent learning deficits［J］.J Neurosci，2003，23(3):876-882.

［3］ Lees G.Molecular mechanisms of anaesthesia:light at the end of the channel［J］?Br J Anaesth，1998，81(4):491-493.

［4］ 靳艷卿，段世明，王 鈞，曾因明.側(cè)腦室注射蠅蕈醇和荷包牡丹堿對(duì)大鼠異氟烷最低麻醉濃度的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2000，14(4):287-290.

［5］ 董曉華，張丹參，孟憲勇.Glu/GABA水平相關(guān)性對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響［J］.中國(guó)老年學(xué)雜志，2006，26(2):283-285.

［6］ 許鵬程，胡志超，戴體俊.安氟烷、異氟烷的遺忘作用及其與γ-氨基丁酸A受體關(guān)系的實(shí)驗(yàn)研究［J］.中國(guó)臨床藥理學(xué)雜志，2009，25(3):242-245.

［7］ 南京藥學(xué)院《中草藥學(xué)》編寫組.中草藥學(xué)［M］.南京:江蘇人民出版社，1976:599.

［8］ Beutler JA，Karbon EW，Brubaker AN，Malik R，Curtis DR，Enna SJ.Securinine alkaloids:a new class of GABA receptor antagonist［J］.Brain Res，1985，330(1):135-140.

［9］ 屈志煒，李和平，張均田.一葉萩堿的腦保護(hù)作用及其作用機(jī)制的初步分析［C］.全國(guó)第二屆神經(jīng)藥理學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編，1985:104.

［10］ Hall AC， Lieb WR， Franks NP. Stereoselective and non-stereoselective actions of isoflurane on the GABAAreceptor［J］. Br J Pharmacol，1994，112(3):906-910.

［11］ Werner DF，Swihart A，Rau V，Jia F，Borghese CM，McCracken ML，et al.Inhaled anesthetic responses of recombinant receptors and knockin mice harboring α2(S270H/L277A)GABAAreceptor subunits that are resistant to isoflurane［J］.J Pharmacol Exp Ther，2011，336(1):134-144.

［12］ 李程程，王 浩，曹志祥，鄭 杰，酉 茜，戴體俊.側(cè)腦室注射荷包牡丹堿對(duì)丙泊酚小鼠逆行性遺忘的影響［J］.徐州醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2007，27(9):604-606.

［13］ 王 丹，戴體俊，馬 濤，孟 晶.側(cè)腦室注射荷包牡丹堿、NMDA對(duì)依托咪酯所致遺忘作用的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2009，25(8):1029-1032.

［14］ 劉 毅，岳志華，張 娜，李 婕.一葉萩堿的研究進(jìn)展［J］.中國(guó)藥事，2009，23(8):817-818，828.