茶多酚錳絡(luò)合物誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的差異蛋白質(zhì)表達

翁鷺娜，蒙偉能，季學(xué)濤，李 程，黃河清

(1.廈門口岸藥品檢驗所藥理學(xué)室，福建廈門 361012;2.廈門大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院生物化學(xué)與生物技術(shù)系，福建廈門 361005)

茶多酚 (tea polyphenol，TP)來源于茶葉，由黃烷醇類、花色素類、花黃素類、縮酸及縮酚酸類組成;其中黃烷醇類又稱為兒茶素類，占TP總量的70%～80%。兒茶素主要由表沒食子兒茶素沒食子酸酯〔(-)-epigallocatechin-3-o-gallate，EGCG)、表沒食子兒茶素、表兒茶素沒食子酸酯和表兒茶素等組成［1－2］。大量實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，EGCG或其他多酚單體不僅能產(chǎn)生誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的藥效，而且具有殺菌效果［3－4］。TP分子內(nèi)的多個鄰位酚羥基可作為配體絡(luò)合許多過渡金屬離子，如鍺(Ge)和錳(Mn)等。近期研究發(fā)現(xiàn)，TP和TP-Ge絡(luò)合物均有誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡的能力，但后者誘導(dǎo)效率明顯高于前者［5］。本研究采用光學(xué)顯微鏡鏡檢法和流式細胞術(shù)分別研究TP-Mn誘導(dǎo)HepG2細胞形態(tài)變化趨勢和細胞凋亡率，并采用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選和鑒定由TP-Mn誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡表達的差異蛋白質(zhì)，為后續(xù)深入研究TP-Mn誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的分子機制、揭示關(guān)鍵蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能以及研制抗腫瘤新藥提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑及主要儀器

HepG2細胞由中國科學(xué)院細胞研究所提供。TP購自福建天寶生物化工廠;Ge和Mn標準溶液由北京國家標準物質(zhì)供應(yīng)部提供;Mn標準溶液，批號BW079815，Ge標準溶液，批號GSB 04-1728-2004。硫酸錳購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司，規(guī)格:AR 500 g。氧化鍺購自上海醫(yī)藥采購供應(yīng)站;2，5-二羥基苯甲酸(DHB)購自美國ICN生物醫(yī)學(xué)公司;三氟乙酸(分析純)等化學(xué)試劑購自上海生物工程有限公司和美國Sigma公司。參照文獻［1］和［5］合成TP-Mn和 TP-Ge。

TE2000-S型熒光倒置顯微鏡，日本 Nikon公司;EPICS XL型流式細胞儀，美國Beckman Coulter公司;ReflexⅢ型MALDI-TOF質(zhì)譜儀，德國 Bruker公司。

1.2 HepG2細胞分組及處理

細胞分為正常對照、TP 700 mg·L－1、TP-Ge 700 mg·L－1和 TP-Mn 700 mg·L－1組，分別作用 HepG2細胞48 h。

1.3 光學(xué)顯微鏡觀察細胞凋亡形態(tài)及流式細胞儀分析HepG2細胞的凋亡率

將培養(yǎng)于6孔板的正常對照、TP處理組;TP-Ge組;TP-Mn組細胞用0.25%的胰蛋白酶消化收集細胞，PBS漂洗后嚴格按照試劑盒說明書要求操作，加入1 ml PI染色液，4℃避光染色30 min后立即上機檢測。

1.4 HepG2細胞全蛋白質(zhì)提取與分離

取培養(yǎng)48 h的HepG2細胞，離心棄去培養(yǎng)液，用PBS洗滌3次。按細胞質(zhì)量和裂解液體積1∶3的比例加入裂解液，液氮反復(fù)凍融破碎細胞。隨后15 000 ×g離心20 min 取上清，以每管30 μl于 －80℃冷凍保存?zhèn)溆谩?D-PAGE技術(shù)分離腫瘤細胞HepG2的全蛋白。參考文獻［6－7］分離試劑配制和實驗步驟。凝膠中的蛋白質(zhì)染色選用常規(guī)的銀染法。

1.5 差異蛋白質(zhì)篩選和質(zhì)譜鑒定

參考陳東仕等［8］和林志超等［9］描述的方法進行質(zhì)譜數(shù)據(jù)檢索和差異蛋白質(zhì)鑒定。

1.6 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 TP-Mn對HepG2細胞形態(tài)的影響

圖1A為無任何處理的HepG2細胞。TP處理的HepG2細胞形態(tài)無明顯變化，但透光性及折光性稍微減弱，細胞數(shù)量明顯減少(圖 1B)。TP-Ge處理的HepG2細胞形態(tài)略有變化呈扁平的短梭形或多角形，細胞單層排列呈“鋪路石”狀，細胞透光性及折光性稍減低，細胞數(shù)量無明顯減少(圖1C)。TP-Mn組的HepG2細胞形態(tài)變化明顯，透光性和折光性差，大部分細胞皺縮變形，并有大量死亡細胞漂浮在培養(yǎng)液中，總的細胞數(shù)量明顯減少，細胞凋亡明顯(圖1D)。

圖1 茶多酚錳絡(luò)合物(TP-Mn)對HepG2細胞形態(tài)的影響(×300).細胞與藥物作用48 h.A:正常對照組;B:TP 700 mg·L －1;C:TP-Ge 700 mg·L －1;D:TP-Mn 700 mg·L －1.Fig.1 Effect of tea polyphenol-manganese(TP-Mn)on HepG2 morphological changes(×300).

2.2 TP-Mn對HepG2細胞凋亡率的影響

圖2結(jié)果顯示，HepG2細胞的自然凋亡率為(7.6±0.7)%;TP，TP-Ge和 TP-Mn組，HepG2 細胞的凋亡率分別為(12.3 ±0.4)%，(7.0 ±0.3)%和(30.1±0.7)%。其中TP和TP-Mn處理組與正常對照組相比差異顯著(P＜0.05)。尤其是TP-Mn處理組，其誘導(dǎo)的凋亡率是TP處理組的2.5倍。

圖2 流式細胞術(shù)檢測TP-Mn對HepG2細胞凋亡的影響.A:正常對照;B:TP 700 mg·L－1組;C:TP-Ge 700 mg·L－1組;D:TP-Mn 700 mg·L－1組.箭頭示凋亡峰.Fig.2 Effect of TP-Mn on HepG2 apoptosis measured with flow cytometry.

2.3 TP-Mn誘導(dǎo)HepG2差異蛋白的表達

未經(jīng)任何處理的HepG2細胞蛋白質(zhì)斑點數(shù)目為1200個，其中多數(shù)蛋白質(zhì)斑點分布在pH 5～8范圍內(nèi)，少量蛋白質(zhì)斑點分布在弱酸和弱堿區(qū)域內(nèi);多數(shù)蛋白質(zhì)的斑點分子量為18～70 ku(圖3A)。TP處理組總蛋白質(zhì)斑點數(shù)目與未經(jīng)任何處理的HepG2細胞很靠近，但存在11種差異蛋白質(zhì)，其中圖中顯示的編碼為6，7，8，12，13，14，15，20和21號蛋白質(zhì)斑點可視為上調(diào)蛋白，而編碼為11，19號的斑點可視為下調(diào)蛋白(圖3B)。TP-Mn處理組蛋白質(zhì)斑點數(shù)目與未經(jīng)任何處理的HepG2細胞也很靠近，其蛋白質(zhì)分布也較為相似，但存在12種差異蛋白質(zhì)，即圖中顯示的斑點編碼為5，9，10和20號蛋白質(zhì)斑點可視為上調(diào)蛋白，而編碼為1，2，3，4，16，17，18和 19號為斑點可視為下調(diào)蛋白(圖3C)。

肽質(zhì)量指紋和數(shù)據(jù)庫比對匹配率分析結(jié)果顯示，較高匹配率的蛋白質(zhì)分別為圖3C中編號為18和19的蛋白斑點，分別為γ-肌動蛋白和酪氨酸3/色氨酸5-加單氧化酶激活蛋白。

圖3TP-Mn誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的2D-PAGE全蛋白圖譜.A:正常對照組;B:TP 100 mg·L－1組;C:TP-Mn 700 mg·L－1組.Fig.3 2D-PAGE proteome map of HepG2 apoptosis induced by TP-Mn.

3 討論

本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，TP和TP-Mn都具有誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的能力，尤其是TP-Mn其誘導(dǎo)的HepG2細胞凋亡率達到(30.1±0.67)%。前期的研究表明TP-Ge只能誘導(dǎo)肺癌細胞凋亡［5］;本研究也表明TP-Ge誘導(dǎo)HepG2細胞凋亡的能力很有限，不具備廣譜性藥效的特點。而TP-Mn則具有廣譜性藥效的特點。

TP中的主要成分EGCG誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的重要機制之一是抑制腫瘤細胞中端粒酶的活性［10］。酪氨酸3-/色氨酸5-單加氧酶激活蛋白可以調(diào)節(jié)端粒酶在細胞內(nèi)的著陸點，從而抑制細胞凋亡［11］。HepG2細胞經(jīng)TP-Mn處理后，使該酶表達量降低，阻礙了端粒酶在腫瘤細胞內(nèi)與靶蛋白結(jié)合，抑制了端粒酶活性，最終導(dǎo)致腫瘤細胞凋亡。此外，細胞內(nèi)的γ肌動蛋白表達量下調(diào)，也導(dǎo)致肌動蛋白纖絲遭到破壞，從而使細胞的正常狀態(tài)發(fā)生改變，加速HepG2 細胞的凋亡［12］。

本研究利用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)初步探討了TP-Mn抗腫瘤分子機制，為進一步深入研究找到了切入點，但還不夠深入和全面，相關(guān)的TP-Mn誘導(dǎo)HepG2細胞途徑和分子機制，還需要借助其他生物化學(xué)和細胞生物學(xué)分析技術(shù)進一步佐證和研究。

［1］ 黃河寧，李安章，翁露娜，林慶梅，黃河清，鄭忠輝，等.茶多酚錳合成、表征及絡(luò)合和誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡的研究［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2007，28(6):1072-1076.

［2］ Bazinet L，Labbé D，Tremblay A.Production of green tea EGC-and EGCG-enriched fractions by a two-step extraction procedure［J］.Sep Purif Technol，2007，56(1):53-56.

［3］ Sharma V，Gulati A，Ravindranath SD，Kumar V.A simple and convenient method for analysis of tea biochemicals by reverse phase HPLC［J］.J Food Compos Anal，2005，18(6):583-594.

［4］ Masukawa Y，Matsui Y，Shimizu N，Kondou N，Endou H，Kuzukawa M，et al.Determination of green tea catechins in human plasma using liquid chromatographyelectrospray ionization mass spectrometry［J］.J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci，2006，834(1-2):26-34.

［5］ 黃河寧，胡曉慧，黃河清，顏 利，陳東仕，歐陽高亮，等.質(zhì)譜技術(shù)研究兒茶素及兒茶素-鍺多聚體特性［J］.分析化學(xué)，2006，34(1):52-56.

［6］ 黃河寧，李 程，謝笠升，黃河清.茶多酚錳-殼聚糖微球的制備、控釋和誘導(dǎo)肝癌細胞凋亡的研究［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2008，29(8):1592-1597.

［7］ 黃 琳，陳東仕，顏 利，方財王，黃河清.在鎘鹽脅迫下用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選與鑒定海兔亞口腔神經(jīng)節(jié)的差異蛋白質(zhì)［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2009，30(2):314-319.

［8］ 陳東仕，黃河清，吳韓志，蔡宗葦.優(yōu)化分離與鑒定藍斑背肛海兔口腔神經(jīng)節(jié)蛋白質(zhì)組［J］.高等學(xué)?；瘜W(xué)學(xué)報，2006，27(7):1257-1261.

［9］ 林志超，林 青，朱 峰，黃河清.電泳和質(zhì)譜技術(shù)研究4種胰臟鐵蛋白的亞基類型和等電點特性［J］.色譜，2009，27(1):96-101.

［10］ Berletch JB，Liu C，Love WK，Andrews LG，Katiyar SK，Tollefsbol TO.Epigenetic and genetic mechanisms contribute to telomerase inhibition by EGCG［J］.J Cell Biochem，2008，103(2):509-519.

［11］ Zhang P，Chan SL，F(xiàn)u W，Mendoza M，Mattson MP.TERT suppresses apoptosis at a premitochondrial step by a mechanism requiring reverse transcriptase activity and 14-3-3 protein-binding ability［J］.FASEB J，2003，17(6):767-769.

［12］ Gourlay CW，Ayscough KR.The actin cytoskeleton in ageing and apoptosis［J］.FEMS Yeast Res，2005，5(12):1193-1198.