印跡殼低聚糖在小鼠體內(nèi)的代謝與組織分布

張曉菲，劉麗宏，丁春雷，楊潤濤，趙長琦

(1.北京師范大學生命科學學院，北京 100875;2.中國人民解放軍第二炮兵總醫(yī)院藥劑科，北京 100088)

殼聚糖，(1，4)-2-氨基-2-脫氧-β-D-葡聚糖，是甲殼素經(jīng)脫乙?；幚淼漠a(chǎn)物，具有良好的生物相容性和生物降解性，無毒，物理和化學性質(zhì)相對穩(wěn)定，目前大量文獻報道殼聚糖作為藥物緩釋載體，并且具有降血脂、降膽固醇、增強抵抗力等多種生理功效，但殼聚糖溶解性能很差，殼低聚糖是相對分子量＜10 000的殼聚糖，其溶解性能較殼聚糖大大改觀，可完全水溶，利于人體的吸收，從而更加發(fā)揮其獨特的生理活性和物化性質(zhì)，如水溶性、保濕性、抗菌性、抗腫瘤和免疫促進性等［1］，使殼聚糖的應用范圍大大加寬，在醫(yī)藥上的應用發(fā)展迅速。目前國內(nèi)外大多數(shù)研究都集中在殼聚糖的功能開發(fā)和應用方面，如藥物緩釋載體、抗凝血、抗菌、降脂和抗氧化［2－3］，但是對殼聚糖特別是水溶性殼低聚糖在體內(nèi)的代謝吸收等過程研究較少，而藥代動力學是其發(fā)揮藥理作用的基礎(chǔ)。殼聚糖藥物代謝的研究已成為迫切需要。

熒光標記是利用化學修飾的方法將熒光分子連接到多糖分子上，起到示蹤作用。常用的熒光素為異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)。有研究表明，F(xiàn)ITC標記殼聚糖方便、快捷、標記率高、方法簡單，F(xiàn)ITC對殼聚糖的體內(nèi)代謝幾乎沒有影響，并且具有準確，靈敏，安全，為非放射性標記等優(yōu)點［4－6］。

本研究中水溶性印跡戊二醛交聯(lián)羧甲基殼低聚糖，簡稱印跡殼低聚糖(imprinted chitooligosaccharides，CTS)，脫乙酰度為95%，平均相對分子質(zhì)量為2460，合成中采用離子印跡技術(shù)［7－8］并增加了一定的功能基團提高其對有害重金屬離子的特異性高效螯合［9］，明確其代謝和體內(nèi)組織分布特點，將有助于判斷此殼聚糖是否可作為體內(nèi)促排藥物，體內(nèi)螯合有害重金屬后通過尿液和糞便排出體外，以用于體內(nèi)重金屬中毒的治療。采用熒光示蹤法FITC標記CTS(FITC-CTS)，尾靜脈注射后檢測FITC-CTS在小鼠體內(nèi)組織分布、代謝及降解情況，為研究CTS的藥代動力學和體內(nèi)發(fā)揮生物活性提供理論依據(jù)，從而有助于指導CTS作為促排劑的研究。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-6AD高效液相色譜，SPD-10AV紫外檢測器和RF-20AXL熒光檢測器，日本Shimadzu公司產(chǎn)品;凝膠排阻色譜柱TSK-gel G2000SW(7.5 mm ×30 cm)，日本Tosoh公司產(chǎn)品;Tecan Safire2型全波長多功能酶標儀，瑞士Tecan公司產(chǎn)品;微量電動組織勻漿器，美國Kimble公司產(chǎn)品。Sephadex G-25，右旋糖酐標準品(相對分子質(zhì)量分別為 180，4600，7100，21400，41100，84 400，133 800)購自中國藥品生物制品檢定所;溶菌酶購自美國 Sigma 公司;HCl，NaOH，NaH2PO4，Na2HPO4和NaCl購自北京化學試劑有限公司。

1.2 CTS及FITC標記

CTS由軍事醫(yī)學科學院藥物毒物研究所合成提供。原料殼聚糖為黏均相對分子質(zhì)量1.65×105，脫乙酰度95%，經(jīng)Cu2+印跡、戊二醛交聯(lián)、脫印跡模板、羧甲基化以及氫化等修飾后H2O2氧化形成低聚水溶性印跡CTS(圖1)，經(jīng)Sephadex G-25凝膠柱，收集分子量最高的幾個組分，并制成凍干粉，得到分子量相對均一的殼低聚糖衍生物。

圖1 印跡殼低聚糖(CTS)結(jié)構(gòu).○代表印跡后留下的“孔穴”.Fig.1 Structure of the imprinted chitooligosaccharide(CTS).

CTS的氨基與FITC連接(圖2)，使 CTS具有FITC的熒光特性。樣品CTS(脫乙酰度為95%)300 mg溶于10 ml水，加入21 mg FTIC，室溫下攪拌72 h，濾紙過濾后加入Sephadex G-25柱 (2.8 cm×30 cm)，洗脫液為 1/15 mol·L－1PBS(含 NaCl 0.2 mol·L－1，pH 5.5)，餾分通過高效凝膠滲透色譜法(high performance gel permeation chromatography，HPGPC)法測定相對分子質(zhì)量分布，收集相對分子質(zhì)量最高的幾個餾分，透析袋(截流相對分子質(zhì)量1000)內(nèi)透析除鹽后制成FITC-CTS凍干粉。

圖2 異硫氰酸熒光素(FITC)標記的CTS.羧甲基化后的殼低聚糖，a，b位分別可部分被羧甲基化.Fig.2 Fluorescein isothiocyanate(FITC)labeled CTS.

1.3 高效凝膠滲透色譜法測定CTS相對分子質(zhì)量

采用HPGDC色譜法，紫外檢測波長為270 nm，流動相 PBS 0.1 mol·L－1，流速 0.5 ml·min－1。右旋糖酐分子量標準品及CTS樣品溶于流動相，0.45 nm微孔過濾器過濾并經(jīng)超聲脫氣，進樣量10 μl，上述條件下得到分子量標準品及待測CTS樣品的典型色譜圖，記錄洗脫峰的保留時間。GPC軟件計算樣品平均相對分子質(zhì)量。

1.4 熒光分光光度法測定CTS含量

FITC熒光采用全波長多功能酶標儀測定熒光強度，激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長520 nm。FITC標記量測定:全波長多功能酶標儀測定FITC標準曲線和FITC-CTS的熒光強度，根據(jù)FITC標準曲線得到FITC濃度－熒光強度公式，測定FITC-CTS標準曲線的熒光強度，計算FITC-CTS的FITC標記率(每克FITC-CTS中FITC含量)。

FITC-CTS標準曲線:FITC-CTS溶于生理鹽水，配制成5 g·L－1的溶液，用生理鹽水逐步稀釋，形成濃度分別為 0，0.3125，0.625，1.25，2.5，5，10 g·L－1的FITC-CTS標準液。取FITC-CTS標準液，加入3倍體積 HCl 1 mol·L－1，混勻后取0.5 ml，加入 NaOH 1 mol·L－1(0.37 ml)，0.2 mol·L－1PBS pH 6.15(1.13 ml)，混勻，Tecan Safire2 全波長多功能酶標儀測定熒光強度，以熒光強度 A為縱坐標，F(xiàn)ITC-CTS濃度為橫坐標，繪制標準曲線，建立回歸方程，c(g·L－1)=8138.6(Ai－ A0)+1.1579，Ai為樣品熒光強度，A0為空白熒光強度;R2=0.9986。

1.5 CTS及FITC-CTS穩(wěn)定性的測定

將 CTS 及 FITC-CTS 2.75 g·L－1溶于 0.1 mol·L－1PBS 中， 加 入 或 不 加 入 溶 菌 酶 (19 mg·L－1)，37℃恒溫水浴，烏氏黏度計測定48 h內(nèi)殼低聚糖相對黏度變化，并用HPGPC法測定相對分子質(zhì)量變化。

1.6 動物分組給藥

雄性昆明小鼠49只，4周齡，體質(zhì)量18～22 g，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心提供，動物許可證號:SYXK(京)2006-0025。實驗前禁食12 h，自由飲水，小鼠尾靜脈iv給予 FITC-CTS 100 mg·kg－1后，于10 min，0.5，1，4，12，24和48 h收集尿液，摘眼球取血0.5 ml置于肝素抗凝離心管中，頸椎脫臼處死后立即解剖取心、肝、脾、肺、腎和股骨，－20℃保存。

1.7 生物樣品預處理

各取等重量或體積的小鼠肝、腎、脾、肺、股骨、血液、尿液、糞樣品，加入等量生理鹽水，除血液和尿液外，電動勻漿器制成勻漿后加入3倍體積的HCl 1 mol·L－1，混勻，800 ×g 離心5 min，取上清液備用，血液離心取上清，加入3倍體積 HCl 1 mol·L－1，混勻，800×g離心5 min，取上清液備用。備用液0.5 ml，加入 0.37 ml NaOH 1 mol·L－1，PBS 0.2 mol·L－1，pH 6.15(1.13 ml)，混勻，Tecan Safire2 全波長多功能酶標儀測定熒光強度(激發(fā)波長495 nm，發(fā)射波長 520 nm)，尿液用 PBS 0.2 mol·L－1pH 6.15 適當稀釋后直接用酶標儀測定。小鼠組織及尿液、血液、糞樣品加入 FITC-CTS 0.625，1.25 和 2.5 g·L－1溶 液，計 算 各 組 織 中FITC-CTS的回收率。根據(jù)FITC-CTS標準曲線和回收率，計算各組織中FITC-CTS濃度和分布量，以及FITC-CTS通過尿液排除量。

1.8 統(tǒng)計學分析

采用GPC軟件繪制標準曲線并進行線性回歸，計算樣品分子量;采用SPSS13.0軟件進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié)果

2.1 CTS的相對分子質(zhì)量，F(xiàn)ITC標記率及溶菌酶中的穩(wěn)定性

根據(jù)右旋糖酐標準品由GPC專用軟件繪制標準曲線，以右旋糖苷標準品相對分子質(zhì)量180，4600，7100，21 400，41 100，84 400，133 800 的對數(shù)值為縱坐標，以相應色譜峰的保留時間為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程:logMr=13.900 － 0.172t，R2=0.9977，根據(jù) CTS樣品保留時間(圖 3)，計算其相對分子質(zhì)量主要分布在1000～20 000，平均相對分子質(zhì)量2460。

圖3 高效凝膠滲透色譜法測定CTS相對分子質(zhì)量.Fig.3 Relative molecular mass of CTS detected by high performance gel permeation chromatogram.

利用Sephadex G-25凝膠柱可將FITC-CTS(相對分子質(zhì)量1000～20 000)與未標記上的FITC(相對分子質(zhì)量384)和少部分小分子量CTS分離，得到分子量相對大的均一的5 ml FITC-CTS餾分。收集的餾分通過HPGPC法測定相對分子質(zhì)量分布范圍(圖4)，餾分6，9，12，15，28的洗脫峰保留時間依次延長，標準品FITC出峰時間最長，餾分中明顯將FITC和小分子量FITC-CTS分離，收集目標分子量FITC-CTS的餾分，透析后制備凍干粉，得到純化的分子量相對均一的FITC-CTS，測定其熒光強度，然后比對FITC標準曲線的熒光強度，計算FITC-CTS中FITC標記率3.8%(每100 g FITC-CTS中 FITC的含量)。

圖4 HPGPC色譜測定FITC-CTS混懸液經(jīng)Sephadex G25柱后不同餾分相對分子質(zhì)量范圍.A～F:FITC和餾分6，9，12，15，28.Fig.4 Relative molecular mass range of fractions of FITCCTS solution through Sephadex G25 column by HPGPC.

CTS及FITC-CTS加入或不加入溶菌酶，烏氏黏度計測定48 h內(nèi)相對黏度都沒有任何變化，HPGPC法測定相對分子質(zhì)量也都無變化，認為 CTS和FITC-CTS不易被溶菌酶降解(數(shù)據(jù)未顯示)。

2.2 FITC-CTS在小鼠體內(nèi)的代謝降解

FITC-CTS在小鼠體內(nèi)不同時間點尿樣的HPGPC圖譜(圖5)，比對相同條件下FITC-CTS原料的圖譜，12 h點前的尿液中有明顯的FITC-CTS峰(峰1，出峰時間8.0 min)，12 h內(nèi)尿液中排出的全部為FITC-CTS原型，排出量較大，12 h的尿液圖譜(圖5D)基本與空白尿圖譜(圖5A)重合，此時原型形式的 FITC-CTS基本從體內(nèi)排完，沒有發(fā)現(xiàn)FITC-CTS降解的跡象。但24 h點尿液(圖5E)又出現(xiàn)較高的單峰(峰2，出峰時間13.0 min)，48 h點尿液(圖5F)中此峰基本又消失，根據(jù)此峰出峰時間和強度分析，認為此峰是降解的FITC-CTS產(chǎn)物，可能是體內(nèi)的某種酶將CTS水解形成較小分子量的FITC-CTS和一定的游離單糖或2～8個單位的小聚合體。人類體內(nèi)缺乏水解殼聚糖的兩種酶殼聚糖酶和β-氨基己糖苷酶，溶菌酶不易催化脫乙酰度高于95%的殼聚糖水解，本實驗中殼低聚糖脫乙酰度95%，可能是體內(nèi)溶菌酶對其部分水解，也可能是體內(nèi)其他酶對CTS有一定水解，但從尿樣圖譜看，相對尿液排出FITC-CTS原型量，而降解的FITC-CTS量很少，可能從黏度計算平均相對分子質(zhì)量分析不會有明顯差異。由于FITC-CTS降解的量很少，尿液中FITC-CTS仍以原型排出為主，認為少量的降解不影響測定原型FITC-CTS在體內(nèi)的分布。

圖5 HPGPC色譜檢測尿液中FITC-CTS及降解物.A～F:0，0.5 h，4 h，12 h，24 h和48 h時間點的尿樣的色譜圖，峰1:FITC-CTS;峰2:FITC-CTS降解產(chǎn)物.Fig.5 FITC-CTS and their metabolites in urine detected by HPGPC.

2.3 FITC-CTS在組織、血漿及尿液中的回收率

取等重量或體積的小鼠肝、腎、脾、肺、股骨、血液、尿液和糞，加入生理鹽水配制的 FITC-CTS 0.625，1.25 和 2.5 g·L－1溶液，熒光分光光度法測定FITC-CTS在各組織中的回收率。根據(jù)回收率公式:R=(∑(Fi×ci))/(∑(ci×ci))(i為樣本號，ci為FITC-CTS的標準濃度，F(xiàn)i=樣品熒光強度－空白熒光強度)，計算各組織中FTIC-CTS的回收率，肝、腎、脾、肺、股骨、血漿和尿液中的回收率分別是80.5%，95.3%，78.3%，70.1%，53.1%，93.8% 和98.2%。

2.4 FITC-CTS在體內(nèi)的分布

如圖6所示，小鼠尾靜脈iv給予FITC-CTS 100 mg·kg－1，F(xiàn)ITC-CTS 在血漿中代謝很快，12 h 血漿中FITC-CTS濃度降低90%。圖7顯示分時間段收集的尿液，1 h內(nèi)尿液中FITC-CTS濃度最高(＞0.8 g·L－1)，1 h 內(nèi)尿液中排出 30%，以后尿液中FITC-CTS濃度隨時間快速下降，12 h后尿液濃度0.02 g·L－1，24 h 后尿液濃度基本為 0，12 h 內(nèi)尿液排出FITC-CTS 80%以上，24 h內(nèi)90%FITC-CTS排出。圖8顯示腎是FITC-CTS分布濃度和分布量最高的組織，可達到體內(nèi)組織中 FITC-CTS總量的60%，其次是肝，達到30%。脾中有很少量分布，肺和股骨中FITC-CTS量基本為零(數(shù)據(jù)未顯示)。FITC-CTS在腎和肝中快速分布，10 min時腎和肝即有較高量分布，腎中4 h FITC-CTS達到峰值(0.263 ±0.013)mg，并在 12 h 內(nèi)保持較高濃度，在肝中1 h達到峰值(0.13 ±0.06)mg，而 48 h后FITC-CTS在腎和肝僅少量殘留。

圖6FITC-CTS在小鼠血漿中的分布情況.±s，n=5.Fig.6 Distribution of FITC-CTS in serum of mice.

圖7FITC-CTS在小鼠尿中分布(A)及排出率(B).±s，n=5.Fig.7 Distribution of FITC-CTS in urine(A)and urine excretion rate(B)in mice.

圖8FITC-CTS在小鼠肝和腎組織中的分布情況.±s，n=5.Fig.8 Distribution of FITC-CTS in liver and kidneys of mice.

3 討論

目前對殼聚糖體內(nèi)代謝的研究大部分是ig，po方式給藥，因為殼聚糖的水溶性差，不易作為水溶性注射劑，而CTS是低聚短鏈的殼聚糖，保留了殼聚糖的基本性質(zhì)，但可以完全水溶，因此應用范圍更廣，目前已經(jīng)有采用水溶性殼聚糖作為藥物緩釋載體的注射劑藥物研究，因此也需要研究殼聚糖注射劑的體內(nèi)代謝。本實驗研究的印跡CTS主要是作為體內(nèi)的有重金屬促排劑為目標，除了其重金屬結(jié)合能力外，考察其進入體內(nèi)能否易溶、易擴散、快速分布到靶器官、快速排除體外無殘留以及不參與體內(nèi)物質(zhì)代謝或其他化學變化，這些組織分布、排泄和體內(nèi)降解特點是判斷其能否作為體內(nèi)促排劑的關(guān)鍵。

N-乙?；瘹ぞ厶悄鼙蝗梭w血清中的溶菌酶部分水解，Onishi等［10］研究50%脫乙酰度的殼聚糖可被溶菌酶快速水解2～8個單糖的低聚體殼聚糖，但隨脫乙?；潭仍龈呷芫杆鈿ぞ厶悄芰ο陆担撘阴６雀哂?5%的殼聚糖不易被水解。本研究中的CTS脫乙酰度為95%，且分子量較普通殼聚糖分子量大大降低，已經(jīng)是低聚體殼聚糖，溶菌酶水解測定結(jié)果為不易被溶菌酶水解，與文獻結(jié)果是一致的，這個特點也符合體內(nèi)促排劑在體內(nèi)不代謝降解的要求。

殼聚糖在組織和血液中的分布與其性質(zhì)有關(guān)，相對分子質(zhì)量較低的殼聚糖更易于快速進入組織和血液，而相同分子量的殼聚糖，水溶性的樣品更快速地在組織和血液中分布［11］。本實驗中水溶性CTS iv給予后快速從血漿轉(zhuǎn)移，這與血漿特殊的迅速轉(zhuǎn)運能力有關(guān)，也與此CTS相對分子質(zhì)量2460遠小于普通殼聚糖(50 000)更易透過血管相關(guān)。大部分FITC-CTS快速分布到腎中，并從腎中快速清除，通過尿液排出體外，有研究大鼠注射給予［3H］殼聚糖也證明殼聚糖主要經(jīng)腎排泄［12］。iv給予FITC-CTS后可快速排出體外，ip［10］和 ig［13］給予殼聚糖后也都可快速排出。FITC-CTS主要分布到了有大血管分布的器官，60%分布到腎，30%可分布到肝，極少部分可分布到脾，其他組織基本無分布。雖然CTS殼聚糖相對分子質(zhì)量大大降低，但仍為大分子物質(zhì)，iv給藥后主要通過血液分布到各組織。

本研究中制備的印跡CTS，螯合重金屬性能強，易溶，具有明顯的腎靶向性，快速從血漿轉(zhuǎn)移至腎，12 h內(nèi)保持較高的濃度，48 h后體內(nèi)基本無殘留，而且這種低聚合物體內(nèi)基本不發(fā)生降解，主要以原型排出體外。這些代謝分布特點，基本符合體內(nèi)促排劑的要求。在下一步的研究中，結(jié)合體內(nèi)代謝分布特點和體外細胞水平評價，將進一步研究這種印跡CTS在體內(nèi)促排有害重金屬的效率和促排的選擇性，為開發(fā)新型的體內(nèi)促排藥物奠定基礎(chǔ)。

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