變構藥物先導化合物
——從偶然發(fā)現(xiàn)到合理設計

張健

（上海交通大學醫(yī)學院，上海 200025）

變構效應（allosteric effect）是一種精確調節(jié)生物大分子功能的機制，指大部分為蛋白質的生物大分子在遠離底物位點或功能位點的其他區(qū)域存在變構位點，這些位點通過傳遞配體結合等作用來造成大分子活性改變的過程。從20世紀初對血紅蛋白的玻爾效應研究開始，到上世紀60年代由Monod和Jacob教授首次提出變構效應這一概念，再到目前美國FDA批準的多個變構藥物上市，變構效應及其在藥物設計中的應用正越來越得到研究者的關注，變構效應更是被稱為“生命的第二秘密”。

變構藥物設計的核心在于發(fā)現(xiàn)變構位點與合理設計變構調節(jié)劑，從而通過間接的方式調節(jié)靶標蛋白活性。相比于靶向蛋白功能位點的正構藥物來說，變構藥物具有一系列天然優(yōu)勢：其一，變構位點理論上可以位于蛋白表面的任何位置，比起長期進化選擇后的蛋白功能位點，變構位點保守性更低，從而變構調節(jié)劑具有更好的亞型選擇性和更低的副作用，具有臨床應用價值；其二，當?shù)孜锖湍繕说鞍捉Y合能力較強或者涉及口袋平坦寬大的蛋白-蛋白相互作用時，很難開發(fā)直接靶向底物位點的藥物分子，而變構調節(jié)劑因并不直接結合在底物位點，此時依然可以調控蛋白活性；其三，變構調節(jié)劑可以和正構位點的分子共同作用，對蛋白活性進行更加精細和復雜的調節(jié)，在精準醫(yī)學領域具有應用可能；其四，由于變構調節(jié)劑對特定構象的結合，只有在正構小分子存在時，變構調節(jié)劑才會對蛋白活性進行調節(jié)，這不僅進一步減少了副作用，也有利于組織特異性給藥途徑的探索。近10年來，變構小分子數(shù)量的激增也證明了變構效應在藥物設計領域受到極大重視。

基于Sirtuin 6（SIRT6）的變構激動劑設計是合理變構藥物設計的一個典型范例。SIRT6是一種組氨酸去乙酰化酶，其功能是將乙酰化賴氨酸側鏈的乙?；D移到煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）上，在抗炎、DNA衰老修復和腫瘤控制中起到重要的作用。研究發(fā)現(xiàn)，SIRT6過表達的小鼠明顯更加長壽，且癌細胞更快凋亡，而對正常細胞沒有影響。因此，SIRT6激動劑的發(fā)現(xiàn)可能具有重要的臨床意義。然而，傳統(tǒng)靶向正構位點的藥物設計策略很難達到激動效果。針對酶激動的難靶問題，變構方法則可以大顯身手。筆者課題組采用自主開發(fā)的Allosite變構位點識別方法，預測了潛在的SIRT6正構位點背側的變構位點。在虛擬篩選超過500萬個化合物后，基于變構調節(jié)劑的打分原則和實驗驗證，成功獲得了EC50在200 μmol· L-1左右的2個化合物，并通過基于結構的藥物設計方法將EC50優(yōu)化到5 μmol· L-1。小分子和SIRT6蛋白的共晶表明，Allosite有效識別了具有激動活性的變構位點，細胞和動物模型實驗也驗證了激動劑的抗肝癌效果。這項研究不僅為靶向SIRT6蛋白的藥物設計提供了良好的先導化合物，促進了對其機制的研究，也為其他酶激動劑的變構設計提供了成功范例。

變構藥物設計因其巨大價值在引起世界各國科研機構和藥物研發(fā)公司重視的同時，也面臨著諸多挑戰(zhàn)，主要包括以下幾點：1）有價值的變構位點發(fā)現(xiàn)困難。正構配體通常結合在明顯而保守的正構位點，而理論上，除了正構位點之外的任何位置都可能成為變構位點，這造成了變構位點確定的困難，同時也難以測定變構位點與正構位點間的作用偶聯(lián)。2）變構耐藥突變容易發(fā)生。由于變構位點進化壓力小，變構位點更容易發(fā)生突變，從而造成變構調節(jié)劑失效，另外由于變構效應涉及蛋白內信號通路，通路上的突變也會造成變構效應的變化。3）變構效應具有種屬特異性。對人源蛋白有效的變構調節(jié)劑對于鼠源蛋白可能就會失效，這對于藥物設計的實驗檢驗步驟較為不利。4）變構調節(jié)劑與蛋白的共晶復合物不易獲得。通常變構調節(jié)劑與蛋白結合力不如正構調節(jié)劑，構效關系不易追溯，同時具有較低的水溶性，因此難以獲得調節(jié)劑-蛋白共晶結構，從而影響了臨床實驗的進行。

作為生命科學、醫(yī)學和化學的交叉領域，變構藥物設計在目前投入大、風險高的新藥發(fā)現(xiàn)領域是一個不可忽視的新方向。近年來，在綜合運用實驗手段和計算機輔助藥物設計方法的基礎上，變構領域的方法學研究已取得了一系列進展，對變構藥物設計的蓬勃發(fā)展起到了助推作用。在變構數(shù)據(jù)庫方面，AlloSteric Database（ASD）和ASBench等高質量數(shù)據(jù)資源對位點預測起到了重要作用；在變構位點發(fā)現(xiàn)方面，Allosite、Corrsite、PARS等方法從變構位點的不同性質出發(fā)進行預測，為研究者們尋找變構位點提供了極大的便利；在變構信號傳遞和突變分析方面，AlloDriver、AlloSigMA、MCPath等方法對變構效應的機制探究做出了一定的貢獻，也促進了變構先導化合物的優(yōu)化；在變構調節(jié)劑打分和預測方面，Alloscore可用于結合活性預測，AlloFinder和CovCys等可用于自動化變構分子探測，均已經在變構藥物設計領域有所建樹。從實驗角度出發(fā)，X射線衍射和冷凍電鏡技術的發(fā)展提供了更多可用于變構藥物設計的生物大分子結構，核磁共振波譜法也對于變構調節(jié)劑的機制研究和輔助結構測定有著很大幫助。近年來，雙電子-電子共振光譜法、氫氘交換質譜法等方法的發(fā)展也在變構效應驗證和探索中發(fā)揮了作用。基于變構研究方法快速發(fā)展，變構調節(jié)劑發(fā)現(xiàn)逐漸規(guī)范化、流程化的事實，變構藥物已經從偶然發(fā)現(xiàn)進入到基于結構的合理藥物設計這一階段。

隨著變構藥物設計進入新階段，一些曾經難成藥的蛋白已經陸續(xù)有了靶向性的變構調節(jié)劑，我國科研人員在變構效應開發(fā)方面也有了初步的成效。以蛋白酪氨酸激酶SHP2變構抑制劑設計為例，研究者沒有選擇難以靶向的高度保守且?guī)д姷拇呋稽c進行藥物設計，而是基于變構位點，試圖通過變構抑制劑將蛋白穩(wěn)定在自抑制構象來發(fā)揮抗腫瘤效果。研究者首先針對常見致病突變E76A進行了20 000個化合物的生化篩選，獲得了對E76A突變體特異性有效，但對正常SHP2無效的化合物，并通過構效關系進一步優(yōu)化，獲得了優(yōu)化后的化合物和蛋白的共晶結構。從結構提示的重要相互作用出發(fā)，研究者進一步優(yōu)化了小分子調節(jié)劑，將其IC50控制在0.7 μmol· L-1，選擇性提高到了30倍左右。最終的化合物在分子水平能夠抑制下游絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路等過程，在細胞水平也能發(fā)揮廣譜的抗癌作用。該SHP2的變構抑制劑對于開發(fā)新的癌癥療法有所裨益。近期，新發(fā)現(xiàn)的針對磷酸甘油酸變位酶1（PGAM1）的變構抑制劑對非小細胞肺癌的控制效果也值得關注。以之前變構抑制劑的共晶結構為基礎，研究者通過調節(jié)磺酰胺的位置，控制了抑制劑和底物的競爭作用，最后成功開發(fā)了HKB99作為PGAM1的抑制劑。該抑制劑不僅可以負向調控3-磷酸甘油酸向2-磷酸甘油酸的轉化，抑制腫瘤代謝和溫伯格效應，也可以削弱PGAM1和α-平滑肌肌動蛋白的相互作用，從而抑制癌細胞生長和轉移，還可以通過活性氧依賴的c-Jun氨基末端激酶（JNK/c-Jun）信號通路引發(fā)癌細胞凋亡。總體上高效控制了非小細胞肺癌的生長和轉移，對未來變構藥物設計也提供了一定參考。在變構激動劑方面，α7型尼古丁乙酰膽堿受體（α7nAChR）的變構調節(jié)劑開發(fā)可以提供較好的范例。α7nAChR的激動有利于諸如精神分裂癥、阿爾茨海默病等神經精神疾病的控制，由于神經系統(tǒng)中有多個該蛋白的其他亞型，設計高選擇性的變構激動劑的需求度很高。從已知2-乙基硫烷基-5-氨基噻唑結構出發(fā)，研究者首先合成了一個小的化合物庫，并篩選其激動活性，對激動活性較好的化合物做不同修飾，之后基于構效關系進一步優(yōu)化結合效力和選擇性最好的一類化合物。最終成功設計了化合物JWX-A1223a作為α7nAChR的選擇性激動劑，同時揭示N6-（2-氯-6-甲基）-苯基是重要的活性基團，為之后的藥物設計鋪平了道路?？偟膩碚f，變構調節(jié)劑設計可以在腫瘤控制、神經疾病治療等方面提供新策略，而合理變構藥物設計是推動這部分研究不可或缺的力量。

總之，經過百余年的發(fā)展，變構調節(jié)劑發(fā)現(xiàn)從“霧里看花”的隨機猜測和偶然發(fā)現(xiàn)，逐漸進入了基于結構的合理設計這一階段。借助日新月異的實驗方法和計算手段，研究人員已經逐漸掌握了變構效應的有關規(guī)律。作為藥物設計領域的一片藍海，變構效應必將吸引更多的科研工作者，最終將為人類健康事業(yè)做出應有的貢獻。