用于改善認(rèn)知障礙的靶向α7型尼古丁乙酰膽堿受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的研發(fā)現(xiàn)狀

王佳杰，王新童，李遠(yuǎn)恒，焦文宣，肖浩然，孫崎*，王克威,3**

（1.北京大學(xué)藥學(xué)院 天然藥物與仿生藥物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100191；2.北京大學(xué)藥學(xué)院分子細(xì)胞與藥理學(xué)系，北京 100191；3.青島大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)系，山東 青島 266021）

1 阿爾茨海默病的臨床表現(xiàn)及治療困境

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD），即老年癡呆癥，是一種進(jìn)行性發(fā)展的神經(jīng)退行性疾病。其主要臨床表現(xiàn)為認(rèn)知和記憶功能不斷惡化，日常生活能力進(jìn)行性減退，并伴有各種神經(jīng)精神癥狀和行為障礙。隨著人口老齡化加劇，中國AD致死人數(shù)由2005年的第8位上升到2017年第5位，達(dá)到45萬人左右。2005—2017年的13年間，從死因死亡數(shù)變化看，AD致死率增長了62.4%[1]。2018年9月，國際AD協(xié)會在官網(wǎng)上發(fā)布了2018年年度報(bào)告[2]，2018年的主題為“3秒鐘”，旨在提醒人們每3秒將新增1名癡呆患者。到2030年，預(yù)計(jì)罹患AD的全球人數(shù)將超過7 000萬人，治療花費(fèi)將高達(dá)2萬億美元并成為首位的醫(yī)療負(fù)擔(dān)。目前，臨床一線使用藥物為旨在增加內(nèi)源性乙酰膽堿神經(jīng)遞質(zhì)的乙酰膽堿酯酶抑制劑，如他克林、多奈哌齊、加蘭他敏等，以及N-甲基-D-天門冬氨酸受體阻滯劑美金剛。遺憾的是這兩類藥物只能緩解輕微AD患者的病情，同時還會導(dǎo)致較為嚴(yán)重的副作用，如患者容易產(chǎn)生幻覺、意識混沌、頭暈、頭痛以及疲倦等不良反應(yīng)；加蘭他敏甚至可以導(dǎo)致Stevens-Johnson綜合征、急性全身發(fā)疹性膿皰病和其他較嚴(yán)重的皮膚反應(yīng)（如多形性紅斑）。此外，腦細(xì)胞代謝激活劑、腦血循環(huán)促進(jìn)劑等也僅用于其臨床的輔助治療。

2003—2014年的12年間，幾乎所有的新藥研發(fā)都是靶向剪切β-淀粉樣前體蛋白（β-amyloid precursor protein，APP）而產(chǎn)生 Aβ1-42短肽的β-和γ-分泌酶[3-4]。許多在早期研發(fā)階段表現(xiàn)出極具潛力的候選藥物在Ⅲ期臨床均慘遭失敗，其中包括輝瑞/強(qiáng)生和禮來各自投資超過10億美元的單抗藥物bapineuzumab和solanezumab以及羅氏研發(fā)的單抗gantenerumab。這些實(shí)驗(yàn)性藥物雖然可以延緩或阻止β-淀粉樣蛋白（amyloid β-protein，Aβ）的聚集，但對患者的認(rèn)知或者記憶并無益處。有關(guān)AD的 Aβ假說也因此受到質(zhì)疑[5]。一項(xiàng)發(fā)表于2016年的研究提示從源頭上減少Aβ似乎并不能有效地治療AD，該研究發(fā)現(xiàn)，Aβ是大腦感染后的免疫應(yīng)激反應(yīng)；Aβ在大腦細(xì)胞組織中扮演有益的角色，而非破壞者；Aβ將入侵大腦的病毒、細(xì)菌和真菌等包裹起來，并將有害的病原體聚集成塊兒，防止它們感染傷害大腦[6]。

2 阿爾茨海默病的治療新學(xué)說及臨床藥物研究進(jìn)展

近5年來，出現(xiàn)了AD的多種致病學(xué)說或治療策略，給處于“嚴(yán)冬”中的AD治療藥物研發(fā)帶來了機(jī)遇和一線希望。這些學(xué)說包括：1）tau蛋白磷酸化[7]。研究提示，tau蛋白磷酸化起初對神經(jīng)元具有保護(hù)作用，而Aβ攻擊tau蛋白的保護(hù)功能直到其功能逐漸喪失。研究人員發(fā)現(xiàn)，激酶p38γ的蛋白協(xié)助tau蛋白發(fā)生保護(hù)性的磷酸化修飾和干擾Aβ產(chǎn)生的毒性。2）基因突變學(xué)說。在TREM2[8]和CD33[9]基因突變的基礎(chǔ)上，科學(xué)家還發(fā)現(xiàn)早發(fā)型AD與21號染色體上的基因有關(guān)，特別是APP基因和位于1號、14號上的PS1和PS2（早老素）基因[10]。3）腦膜淋巴管功能障礙[11]。AD小鼠中發(fā)現(xiàn)了腦膜淋巴管障礙，因此，腦膜淋巴管有望成為預(yù)防和治療AD的理想靶標(biāo)之一。4）病毒感染學(xué)說[12]。Dudley教授團(tuán)隊(duì)在AD患者大腦樣本中發(fā)現(xiàn)，人類皰疹病毒（HHV）6A和7的水平明顯上升，且與AD呈正相關(guān)。5）細(xì)菌感染學(xué)說[13]。加州大學(xué)舊金山分校的Stephen Dominy博士領(lǐng)導(dǎo)的團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)，引起牙周炎的牙齦卟啉菌同樣會導(dǎo)致AD。在該研究中，研究者先是在AD患者的大腦中檢測到了牙齦卟啉菌的存在，又通過小鼠實(shí)驗(yàn)證實(shí)牙齦卟啉菌進(jìn)入大腦后釋放牙齦蛋白酶。牙齦蛋白酶具有幫助細(xì)菌定植、壓制宿主免疫系統(tǒng)以及破壞組織等多種作用，并對很多細(xì)胞具有毒性。6）運(yùn)動學(xué)說[14-15]。科學(xué)家們通過研究鑒別出了一種運(yùn)動相關(guān)的激素——鳶尾素（irisin）。研究者表示，鳶尾素是一種因運(yùn)動/鍛煉而產(chǎn)生的機(jī)體激素，其在大腦功能上扮演著關(guān)鍵角色，AD患者機(jī)體中攜帶的鳶尾素水平較低，該激素或能幫助有效減緩AD的進(jìn)展。7）Aβ堵塞細(xì)胞間隙誘發(fā)AD[16]?？茖W(xué)家通過磁示蹤成像技術(shù)研究發(fā)現(xiàn)，Aβ的聚集可導(dǎo)致腦部神經(jīng)元周圍微環(huán)境阻塞，誘發(fā)其細(xì)胞間隙內(nèi)的類淋巴液流動困難，致使代謝廢物、激素、營養(yǎng)物質(zhì)等無法順利在細(xì)胞周圍進(jìn)行交換，失去應(yīng)有的功能，從而造成深層海馬神經(jīng)元死亡，空間記憶缺失。同時研究還證實(shí)，應(yīng)用納米紅光粉碎在腦中由Aβ沉積而成的老年斑，可再次疏通細(xì)胞外間隙，恢復(fù)細(xì)胞間液的流動，從而挽救受損的記憶。8）腸道菌群紊亂導(dǎo)致的老年癡呆[17]。研究人員發(fā)現(xiàn)，AD模型小鼠的腸道細(xì)菌組成明顯不同于健康小鼠，調(diào)節(jié)腸道菌群極有可能成為預(yù)防和延緩AD的新方法。9）小膠質(zhì)細(xì)胞參與引起免疫系統(tǒng)失衡而導(dǎo)致的慢性神經(jīng)炎癥[18]。小膠質(zhì)細(xì)胞是胚胎造血起源的中樞神經(jīng)系統(tǒng)常駐髓細(xì)胞。與大多數(shù)組織巨噬細(xì)胞一樣，小膠質(zhì)細(xì)胞會尋找大腦中的病原體，并支持中樞神經(jīng)系統(tǒng)的穩(wěn)態(tài)和可塑性。截至目前，有證據(jù)表明小膠質(zhì)細(xì)胞在AD發(fā)病機(jī)制中既可發(fā)揮有益作用也會帶來有害作用。在AD早期，它們可以監(jiān)控并清除死細(xì)胞及具有毒性的β-樣淀粉斑和tau結(jié)，但到了AD后期，慢性發(fā)炎的小膠質(zhì)細(xì)胞可能在清除碎屑方面變得失去效力，反而噴出有害的細(xì)胞因子來破壞附近的神經(jīng)元，這無疑會加重AD的癥狀[19]。

相對于其他新的學(xué)說，調(diào)節(jié)腸道菌群治療AD的藥物研發(fā)取得了突破性的進(jìn)展。2018年7月，由中國海洋大學(xué)管華詩院士團(tuán)隊(duì)、中國科學(xué)院上海藥物研究所耿美玉教授團(tuán)隊(duì)和上海綠谷制藥聯(lián)合研發(fā)的甘露寡糖二酸（GV-971）在中國完成了Ⅲ期臨床試驗(yàn)，其可以通過調(diào)節(jié)腸道菌群失衡、重塑機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)，進(jìn)而降低腦內(nèi)神經(jīng)炎癥，阻止AD病程進(jìn)展[20]。2019年下半年，GV-971雖在中國獲批上市，但其療效仍需進(jìn)行長時間臨床觀察和統(tǒng)計(jì)。此外，目前處于美國Ⅱ、Ⅲ期臨床的多個小分子藥物，如色甘酸-布洛芬的組合（ALZT-OP1）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）、 米 諾 環(huán) 素（minocycline）、VX-745（neflamapimod）、吡格列酮（pioglitazone）、沙利度胺（thalidomide）等，其抗AD活性均與抑制神經(jīng)炎癥的作用機(jī)制相關(guān)。

目前，從Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段的藥物的作用機(jī)制看，提高認(rèn)知癥狀是AD治療藥物研發(fā)的活躍領(lǐng)域（見圖1紫色部分）。

圖 1 目前Ⅱ、Ⅲ期臨床試驗(yàn)階段治療阿爾茨海默病藥物的作用機(jī)制[21]Figure 1 Mechanisms of action of agents for treatment of Alzheimer's disease in phases II and III clinical trials [21]

3 α7型尼古丁乙酰膽堿受體變構(gòu)調(diào)節(jié)劑及其改善認(rèn)知障礙作用

3.1 α7型尼古丁乙酰膽堿受體特點(diǎn)及調(diào)節(jié)劑的類型

α7型尼古丁乙酰膽堿受體（α7 nAChR）是同源五聚體跨膜蛋白組成的配體門控離子通道超家族的成員，該超家族類似的受體還包括5-羥色胺（5-HT3）受體和GABAA等受體[22]。α7受體具有高鈣離子通透性（PCa∶PNa 約為10），調(diào)節(jié)鈣的活化和乙酰膽堿遞質(zhì)的釋放，直接影響認(rèn)知和記憶功能。α7 nAChR分布在海馬和相關(guān)皮層，敲除α7 nAChR會導(dǎo)致小鼠注意力不集中和學(xué)習(xí)能力下降等現(xiàn)象[23]。

基于AD致病機(jī)制的膽堿能缺陷假說，提高膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能仍是目前抗AD藥物研發(fā)的主要策略，體現(xiàn)在增強(qiáng)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)的功能靶向α7 nAChR的新型激動劑和正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的研發(fā)。

EVP-6124是選擇性部分激動α7 nAChR的最具代表性化合物[24]，其在大鼠模型中能很好地透過血腦屏障，在其治療精神分裂癥的Ⅱ期臨床試驗(yàn)中顯示了明顯改善認(rèn)知功能和陰性癥狀（如感情淡漠、思維混亂等）的功效[25]。但Ⅲ期臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，EVP-6124在提高試驗(yàn)對象的認(rèn)知水平方面并未表現(xiàn)出比安慰劑更好的效果。2015年9月FDA在對其治療AD的Ⅲ期臨床試驗(yàn)中報(bào)告了胃腸道副作用[26]，2016年3月24日，F(xiàn)ORUM Pharmaceuticals公司正式宣布其Ⅲ期臨床試驗(yàn)失敗，研發(fā)終止[27]。

研究人員于1965年初次提出了變構(gòu)調(diào)節(jié)的概念，用來解釋抑制劑不是底物空間類似物時特定酶在代謝途徑活性的反饋抑制[28-30]。1965年，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)可以將Monod-Wyman-Changeux（MWC）模型（見圖2[31]）應(yīng)用于神經(jīng)遞質(zhì)受體[32]。從藥理學(xué)角度來看，受體可被認(rèn)為具有3個關(guān)鍵的結(jié)合位點(diǎn)（見圖2[31]）：1）內(nèi)源或合成激動劑、競爭性拮抗劑結(jié)合的正構(gòu)位點(diǎn)（orthosteric sites）；2）生物活性位點(diǎn)；3）變構(gòu)位點(diǎn)（allosteric sites）。

圖 2 Monod-Wyman-Changeux模型[31]Figure 2 Monod-Wyman-Changeux model [31]

對于α7 nAChR，正構(gòu)位點(diǎn)區(qū)別于變構(gòu)位點(diǎn)，激動劑或部分激動劑必須與受體結(jié)合且使受體產(chǎn)生離子傳導(dǎo)的構(gòu)象；與變構(gòu)位點(diǎn)結(jié)合的配體則不能單獨(dú)激活受體，而是通過改變與功能構(gòu)象相關(guān)的能量屏障來調(diào)節(jié)激動劑誘發(fā)的反應(yīng)[33]。即變構(gòu)調(diào)節(jié)劑與受體結(jié)合后不會使通道開放，而在激動劑存在的情況下會調(diào)節(jié)受體的開放程度，表現(xiàn)在電生理上即對激動劑引發(fā)的電流大小產(chǎn)生影響。根據(jù)影響的方向可將變構(gòu)調(diào)節(jié)劑分為正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（positive allosteric modulator，PAM）、負(fù)向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（negative allosteric modulator，NAM，即非競爭性抑制劑）和沉默變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（silence allosteric modulator，SAM）[34]。SAM本身對激動劑的電流沒有調(diào)節(jié)作用，但是由于和PAM、NAM等競爭變構(gòu)調(diào)節(jié)位點(diǎn)，因此可以減弱或屏蔽PAM、NAM的變構(gòu)調(diào)節(jié)作用。此處只介紹α7 nAChR正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑（α7 nAChR PAMs）。

不同于激動劑，α7 nAChR PAMs通過內(nèi)源性遞質(zhì)提高受體的功能表達(dá)。由于其不直接作用于受體，不易產(chǎn)生脫敏現(xiàn)象，潛在的毒副作用也會大大下降[33,35]。根據(jù)文獻(xiàn)，α7 nAChR PAMs具有增加學(xué)習(xí)記憶的作用[36]。實(shí)驗(yàn)表明：缺乏α7 nAChR亞基的小鼠與含有該亞基小鼠的對照組相比，在水迷宮實(shí)驗(yàn)中學(xué)習(xí)記憶能力降低。

根據(jù)目前的文獻(xiàn)報(bào)道，α7 nAChR PAMs可分為Ⅰ型和Ⅱ型兩類。Ⅰ型PAM只會增大α7電流的峰值，并不會影響通道的脫敏速度；而Ⅱ型PAM不僅會增大α7電流峰值，還會減緩α7 nAChR脫敏速度，延長通道的開放時間（見圖3[37]）。Ⅱ型PAM呈現(xiàn)緩慢的反應(yīng)衰減動力學(xué)特征，甚至能夠激動已被高濃度激動劑作用脫敏的受體。目前能進(jìn)入臨床研究階段的基本都是Ⅰ型PAM，Ⅱ型PAM由于導(dǎo)致α7 nAChR過度開放而產(chǎn)生神經(jīng)細(xì)胞毒性，因而很難進(jìn)入臨床研究階段。另外，隨著不斷的探索，目前還確定了作用效果介于二者之間的PAM[38-39]。

圖 3 Ⅰ型和Ⅱ型正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對α7型尼古丁乙酰膽堿受體電流失活動力學(xué)影響的差異Figure 3 Comparison between types I and II positive allosteric modulators on desensitization kinetics of α7 nAChR currents

目前對于PAM的變構(gòu)調(diào)節(jié)機(jī)制有很多種解釋，其中一種解釋是，PAM降低了α7 nAChR關(guān)閉態(tài)和開放態(tài)之間的能壘，因此通道更容易從關(guān)閉態(tài)進(jìn)入開放態(tài)，即α7 nAChR對ACh更敏感，圖4中實(shí)線和虛線分別代表無PAM和有PAM作用下α7 nAChR的關(guān)閉態(tài)和開放態(tài)之間的能壘。大圓點(diǎn)代表激動劑，小圓點(diǎn)表示通道通透的陽離子。另一種解釋是，如圖5所示，PAM可以使α7 nAChR的脫敏態(tài)時的構(gòu)象變得不穩(wěn)定，因此通道更傾向于處于開放態(tài)的構(gòu)象[36-37,40]。

圖 4 正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑對于α7型尼古丁乙酰膽堿受體關(guān)閉態(tài)和開放態(tài)之間能壘的影響[37]Figure 4 Effects of positive allosteric modulator on the energy barrier between closed and open states of α7 nAChR [37]

圖 5 α7型尼古丁乙酰膽堿受體的關(guān)閉態(tài)、開放態(tài)和脫敏態(tài)之間的相互轉(zhuǎn)換[37]Figure 5 Interchange between closed, open and desensitized states of α7 nAChR [37]

3.2 α7型尼古丁乙酰膽堿受體參與的神經(jīng)抗炎機(jī)制研究

α7 nAChR也分布于中樞神經(jīng)的免疫細(xì)胞中，其中包括小膠質(zhì)細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的免疫效應(yīng)細(xì)胞和數(shù)量最多的“巨噬細(xì)胞”，具有內(nèi)源性免疫防御功能，約占腦內(nèi)所有膠質(zhì)細(xì)胞的5% ～ 20%（見圖6[41]）。小膠質(zhì)細(xì)胞具有分泌炎性因子、細(xì)胞因子和神經(jīng)營養(yǎng)因子等作用，參與腦內(nèi)的先天性免疫應(yīng)答，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)抵御外界刺激的第一道防線[42-43]?；罨男∩窠?jīng)膠質(zhì)細(xì)胞可以通過釋放自由基、細(xì)胞因子和毒性因子引起神經(jīng)元直接或間接損傷，從而加重了炎癥反應(yīng)的強(qiáng)度[44]。Tracey[45]最早系統(tǒng)闡明了關(guān)于α7 nAChR在炎癥中的作用，提出了膽堿能抗炎途徑是免疫系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)之間的潛在聯(lián)系（見圖7[46]）。激動α7 nAChR的活性可以抑制神經(jīng)炎癥，靶向神經(jīng)炎癥中的免疫機(jī)制通路可能成為未來治療或預(yù)防AD的策略[47]。

3.3 α7型尼古丁乙酰膽堿受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的結(jié)構(gòu)及活性

近年來，科研工作者們致力于探尋活性高且毒性低的α7 nAChR PAMs，最初發(fā)現(xiàn)的I型α7 nAChR PAM多來源于現(xiàn)有的、具有其他活性和機(jī)制的化合物（1a ～ 1d，見圖8），抗寄生蟲藥1a（伊維菌素，IVM）是首個被定義為α7 nAChR PAM的化合物，其可增強(qiáng)ACh的最大電流并稍稍減少脫敏時長[48]。隨后乙酰膽堿酯酶抑制劑1b（加蘭他敏）被報(bào)道可以增強(qiáng)ACh對α7 nAChR的效應(yīng)電流[49]。“第1代”α7 nAChR PAM普遍缺少理想的效能、作用強(qiáng)度及選擇性。例如，IVM無受體亞型選擇性[50]；加蘭他敏僅有較弱的PAM作用且無選擇性[51]，并且通過抑制乙酰膽堿酯酶發(fā)揮的雙重機(jī)制發(fā)揮改善認(rèn)知的作用；化合物1c（5-羥色胺）PAM作用較弱且需要較高的濃度（1 ～ 20 mmol · L-1）來增強(qiáng)激動劑電流，并同時調(diào)節(jié)5-HT3受體；黃酮類酪氨酸激酶抑制劑1d（金雀異黃素）的選擇性與活性也并不理想[52]。

為改善“第1代”PAM的不足，越來越多的具有不同作用強(qiáng)度和選擇性的小分子被相繼報(bào)道（2aa ～ 2ak，見表 1）。

圖 6 神經(jīng)炎癥和阿爾茨海默病的關(guān)系Figure 6 The relationship between neuroinflammation and Alzheimer's disease

圖 7 α7型尼古丁乙酰膽堿受體激活的抗炎級聯(lián)反應(yīng)Figure 7 Anti-inflammatory cascade activated by α7 nAChR

圖 8 典型的I型α7型尼古丁乙酰膽堿受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑Figure 8 Typical type I α7 nAChR positive allosteric modulators

表 1 文獻(xiàn)報(bào)道的重要α7型尼古丁乙酰膽堿受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的結(jié)構(gòu)與活性Table 1 Structure and activity of important α7 nAChR positive allosteric modulators reported in literature

化合物2aa（PNU-120596）是目前研究較充分的首個選擇性脲類Ⅱ型α7 nAChR PAM，由輝瑞公司開發(fā)，Emax為625% ± 165%[56]。體內(nèi)研究顯示，該化合物可以改善由苯丙胺誘發(fā)的大鼠感覺門控障礙，改善在嚙齒類短期認(rèn)知記憶模型中的表現(xiàn)，并且增加cAMP反應(yīng)元件結(jié)合蛋白的磷酸化（cAMP response element-binding protein，CREB），這一生化過程被公認(rèn)為與學(xué)習(xí)和記憶有關(guān)[57]。然而，通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出盡管PNU-120596增強(qiáng)了乙酰膽堿酯酶抑制劑在嚙齒類動物和非人類靈長類動物中的認(rèn)知作用，但由于鈣離子流入過多而導(dǎo)致其具有潛在的毒性作用，因此無法進(jìn)入臨床試驗(yàn)。

Timmermann等[58]針對是否具有α7 nAChR的變構(gòu)調(diào)節(jié)活性，對幾千個化合物進(jìn)行篩選，得到化合物2ab（NS-1738）， 其 EC50為 3.4 μmol · L-1；Emax為322%，是一個典型的雙芳基脲類衍生物，對α7 nAChR表現(xiàn)為I型PAM?；衔?aa與2ab同為脲類衍生物，但與化合物2aa不同的是，化合物2ab對α7 nAChR的脫敏動力學(xué)僅展現(xiàn)出邊緣的影響，表明這些分子可能有不同的作用機(jī)制或位點(diǎn)，同時化合物2ab 在緩解東莨菪堿引起的認(rèn)知功能障礙時可增強(qiáng)激動劑效力。2-氨基-5酮噻唑類衍生物2ac（LY-2087101）為I型PAM[59]；四氫喹啉類衍生物2ad（TQS）與化合物2aa同為Ⅱ型PAM，其pEC50為5.5，Emax為418% ± 25%[52]。但是將化合物2ad中的萘基轉(zhuǎn)變?yōu)?-溴-苯基后得到的化合物2ae（4BP-TQS），其 EC50為 17 μmol · L-1，Emax為 4 500% ± 800%[60]，說明取代基的體積大小對于PAM活性具有一定的影響，體積小的取代基對于α7 nAchR 的親和力更強(qiáng)，活性更強(qiáng)，這為今后的結(jié)構(gòu)修飾提供了思路。

來自加利福尼亞大學(xué)歐文分校的研究人員從一個GABAA受體PAM類似物的小型化合物庫中篩選出了具有高度選擇性的I型PAM——化合物2af（CCMI或AVL3288），通過雙電極電壓鉗測得其EC50為0.7 μmol · L-1，Emax為 900%[61]，并且在嚙齒類動物模型中，該化合物可以在存在或不存在激動劑的情況下使用，不僅能糾正感覺缺陷而且還能改善認(rèn)知能力。2017年，化合物2af進(jìn)入針對精神分裂癥的I期臨床試驗(yàn)，這表明I型PAM可以安全地應(yīng)用于人類，并且對神經(jīng)認(rèn)知產(chǎn)生潛在的積極作用。文獻(xiàn)報(bào)道的其他PAM還包括：1）化合物2ag（SB-206553），其最初作為5-HT2B和5-HT2C的拮抗劑被研究，后來發(fā)現(xiàn)其能通過I型PAM的機(jī)制逆轉(zhuǎn)由地卓西平（dizocilpine，MK-801）誘導(dǎo)的前脈沖抑制（PPI）聽覺門控缺陷[38]；2）化合物2ah（JNJ-1930942，Ⅱ型PAM），其EC50為 1.9 μmol · L-1；Emax為 2 100% ± 500%[39]。

化合物2aa（Ⅱ型PAM）與化合物2ab（I型PAM）同屬于脲類α7 nAChR PAM，但作用類型不同，這種現(xiàn)象也體現(xiàn)在2-芳氨基噻唑類化合物2ac（I型PAM）和2ah（Ⅱ型PAM）上。說明I型和Ⅱ型PAM的作用位點(diǎn)結(jié)構(gòu)非常類似，保持相同母核而改變不同取代基，可以開發(fā)不同類型的變構(gòu)調(diào)節(jié)劑，作用類型可通過電生理信號或單通道膜片鉗記錄來確定。此外，表1中化合物2ak（A-867744）于2009年被發(fā)現(xiàn)，起初研究人員只是單純地認(rèn)為其是Ⅱ型PAM，但隨著近年不斷地深入研究，發(fā)現(xiàn)其在長時間使用時表現(xiàn)為Ⅱ型PAM，但同時其也能像I型PAM那樣，以毫秒級的精確度跟蹤短暫的激動劑釋放脈沖。從治療角度看，化合物2ak的特殊性似乎很有利，因?yàn)槠渚哂幸欢↖型PAM的性質(zhì)使其在安全性方面比起常規(guī)的Ⅱ型PAM要高，但是科研工作者隨后證明了在激動劑濃度的生理時空模式下Ⅱ型PAM的作用可能存在很大差異，也就是說，當(dāng)利用α7 nAChR的PAM作為前瞻性藥物進(jìn)行開發(fā)時，有必要對作用機(jī)制進(jìn)行更詳細(xì)的研究[62]。

盡管這些“第2代”PAM在大體上提供了一定的效用和療效，但是一些PAMs依然缺少α7受體選擇性。例如，化合物2af來自GABA化合物庫，2ag是5-HT2B或5-HT2C受體拮抗劑，2ac同時也是α4β2 nAChR 和 α4β4 nAChR 的 PAM；此外，化合物 2ab、2ad、2ak 展現(xiàn)出對 α4β2 nAChR 和 α3β4 nAChR的抑制作用。增加PAM對α7 nAChR的選擇性也將成為未來研究的主要方向之一。

4 筆者課題組在α7型尼古丁乙酰膽堿受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑研發(fā)方面的進(jìn)展

筆者利用課題組發(fā)展的10余個新穎的多組分反應(yīng)[63-65]和金屬催化偶聯(lián)反應(yīng)[66-72]，合成了結(jié)構(gòu)新穎的噻唑并雜環(huán)類化合物等。對噻唑環(huán)及環(huán)上2-位的烷硫基簡單修飾之后，構(gòu)建了一定種類和數(shù)量的化合物庫。隨后經(jīng)離子通道靶點(diǎn)平臺篩選，發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的苗頭化合物3aa（LD486），并在其具有α7 nAChR PAM活性的基礎(chǔ)上，以噻唑[4，5-d]嘧啶-7(6H)-酮為母核進(jìn)行了結(jié)構(gòu)優(yōu)化，合成了多個系列近百個衍生物（見圖9）。利用雙電極電壓鉗的實(shí)驗(yàn)手段，將人源α7 nAChR表達(dá)于非洲爪蟾卵母細(xì)胞中，以 100 μmol · L-1的乙酰膽堿（ACh）溶液激活α7受體，統(tǒng)計(jì)給予 10 μmol · L-1待篩選化合物溶液前后，α7受體尖端電流（即α7電流最大信號）的變化百分比，由此評估待篩選化合物的α7 nAChR的PAM活性強(qiáng)弱。其中化合物3ea（JWX-A1223）在 ACh 濃度為 100 μmol · L-1時的最大電流信號增加1 633% ± 87%（n= 5，見圖10A），該化合物的EC50為（1.26 ± 0.18） μmol · L-1（n= 5），Hill 系數(shù)（nH）為1.85 ± 0.24（n= 5，見表2）。

靶點(diǎn)選擇性研究發(fā)現(xiàn)，化合物3ea對其他亞型α3β4 nAChR、α4β2 nAChR 和 5-HT3A無 結(jié)合（ 見圖10B），具有專一性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)。另外，初步毒性研究發(fā)現(xiàn)，該化合物無明顯的心臟hERG（human Ether-a-go-go-Related-Gene，一種表達(dá)于心肌細(xì)胞的、具有快速激活延遲整流特性的鉀離子通道，在心肌動作電位復(fù)極過程中發(fā)揮重要作用）通道抑制作用。藥動學(xué)和血腦屏障透過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，其腦組織分布濃度是血漿中的2倍以上。精神分裂癥模型小鼠的PPI實(shí)驗(yàn)表明，化合物3ea可以濃度依賴性地（劑量為 0.1 ～ 1.0 mg · kg-1）恢復(fù) 0.1 mg · kg-1MK-801 所造成的聽覺門控失調(diào)（見圖11）?；衔?ea作為α7 nAChR的PAM，活性好、專一性好、作用部位集中，無明顯針對hERG的心臟安全性風(fēng)險(xiǎn)，且在動物實(shí)驗(yàn)中也展現(xiàn)了針對小鼠精神分裂癥模型較好的恢復(fù)作用，這對于后續(xù)該母核的進(jìn)一步結(jié)構(gòu)改造以及靶向α7 nAChR的正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑類藥物的研究都有著重要的意義。目前該研究結(jié)果已發(fā)表在權(quán)威藥物化學(xué)雜志JournalofMedicinalChemistry上，并在其2019年第1期專刊——“變構(gòu)調(diào)節(jié)劑”上發(fā)表[73]。此外，筆者課題組還對候選藥物3ea進(jìn)行了成藥性評價，申請了中國專利和國際PCT專利并獲美國專利授權(quán)。

圖 9 以噻唑[4,5-d]嘧啶-7(6H)-酮為母核的結(jié)構(gòu)優(yōu)化[73]Figure 9 Structural optimization of thiazolo [4,5-d]pyrimidin-7 (6H)-ones[73]

圖 10 化合物3ea對爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的人源α7型尼古丁乙酰膽堿受體功能的選擇性增強(qiáng)作用[73]Figure 10 Selective enhancement of human α7 nAChR expressed in Xenopus oocytes by compound 3ea [73]

圖 11 化合物3ea對于前脈沖抑制損傷的小鼠的逆轉(zhuǎn)效果[73]Figure 11 Reversion of compound 3ea on the prepulse inhibition impairment in mice [73]

此外，筆者課題組最初對苗頭化合物4進(jìn)行修飾，發(fā)現(xiàn)將母核換為吡啶環(huán)時化合物5的PAM活性顯著提高，而這種結(jié)構(gòu)又是煙酰胺類似物6（維生素B3酰胺化后的形式），通過對其結(jié)構(gòu)修飾，開發(fā)了一系列新的化合物7；利用相同的雙電極電壓鉗手段評價后發(fā)現(xiàn)，該系列化合物為α7 nAChR的I型PAM（見圖12）。其中化合物7ai活性較強(qiáng)[EC50=（3.34±1.13）μmol · L-1]，在 100 μmol · L-1Ach作用下，α7電流的最大電流信號為1 474%±246%（見圖13及表2）；相對于其他nAChR和5-HT3A受體亞型，其對α7 nAChR具有高度特異性（見圖13B）。綜上所述，通過對不同的苗頭化合物進(jìn)行深入的分析和母核改造，筆者課題組得到了以化合物3ea和7ai為代表的兩類不同母核的α7 nAChR的Ⅰ型PAM。除化合物3ea系列的噻唑[4，5-d]嘧啶-7(6H)-酮母核外，活性好、作用受體單一的化合物7ai也為筆者課題組后續(xù)對于靶向于α7 nAChR的吡啶并嘧啶酮類母核的研發(fā)提供了新的思路。目前該研究結(jié)果已發(fā)表在Bioorganic&Medicinal ChemistryLetters上[74]。

圖 12 α7型尼古丁乙酰膽堿受體正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑的結(jié)構(gòu)優(yōu)化及代表化合物7ai [74]Figure 12 Structural optimization of α7 nAChR positive allosteric modulators and the representative compound 7ai [74]

5 結(jié)語與展望

老年癡呆病的發(fā)病學(xué)說和新藥研發(fā)是當(dāng)前研究熱點(diǎn)并充滿挑戰(zhàn)。近年來，靶向于α7 nAChR提高學(xué)習(xí)認(rèn)知能力、改善老年癡呆病癥狀，已逐漸成為新的研發(fā)共識。

鑒于膽堿受體-神經(jīng)抗炎通路對抗老年癡呆病的協(xié)同作用和筆者課題組對此研究領(lǐng)域的深入認(rèn)識，筆者課題組未來的工作將集中在以下2個方面：1）系統(tǒng)確證α7 nAChR正向變構(gòu)調(diào)節(jié)劑是否發(fā)揮既能增強(qiáng)學(xué)習(xí)記憶能力又降低神經(jīng)炎癥的作用，而成為治療老年癡呆的一種有效策略或方案；2）完成1 ～ 2個新型噻唑[4，5-d]嘧啶-7(6H)-酮類小分子候選化合物的臨床前研究，并推動進(jìn)入臨床試驗(yàn)用于改善老年癡呆癥的認(rèn)知障礙功能。

圖 13 化合物7ai對爪蟾卵母細(xì)胞中表達(dá)的人源α7型尼古丁乙酰膽堿受體功能的選擇性增強(qiáng)作用[74]Figure 13 Selective enhancement of human α7 nAChR expressed in Xenopus oocytes by compound 7ai [74]

表 2 代表化合物3ea和7ai作用于α7型尼古丁乙酰膽堿受體的正向變構(gòu)調(diào)節(jié)活性參數(shù)Table 2 The α7 nAChR positive allosteric modulation parameters of representative compounds 3ea and 7ai