蛋白動態(tài)變構調節(jié)與藥物開發(fā)

（浙江省食品藥品檢驗研究院，浙江杭州 310051）

繼揭秘DNA機制之后，變構調節(jié)成為生命活動中的第二大奧秘，而且它在細胞信號轉導與疾病中承擔著一個舉足輕重的角色。變構調節(jié)（Allosteric regulation）的生物學表現(xiàn)為通過一個配體或者小分子結合到蛋白質的非活性區(qū)域（即變構位點）來調節(jié)該蛋白的功能活性。早在1906年前，Monod和Jacob就首次提出了一個新的概念—變構，用來解釋酶活性的反饋調節(jié)機制，揭示了變構調節(jié)在代謝活性調控與蛋白合成控制中扮演了重要的角色[1-3]，這是對變構調節(jié)的經典詮釋，主要針對的對象是折疊的寡聚體蛋白。變構調節(jié)主要由兩部分組成，一部分是配體與蛋白質結合發(fā)生了相互作用。在這方面，變構調節(jié)有一個經典例子就是許多低聚蛋白的合作配體結合，其中底物與一個亞基的結合影響了其他相同亞基的配體親和力。早期科學家們用MWC（Monod-Wyman-Changeux）和KNF（Koshland-Nemethy-Filmer）模型來解釋這種協(xié)同性[4-5]；第一個模型強調對稱守恒來穩(wěn)定幾種蛋白可能狀態(tài)中的一種，而后者則假設了一個誘導擬合情形。韋伯證明了這兩個模型都可以集成在一個通用的物理框架中，基于自由能解釋的變構描述引入了相關術語變遷和構象選擇。Cui和Karplus在其綜述中對經典模型與變構的“新觀點”之間的關系進行了明確的討論，指出MWC/Weber形式主義已經包括了蛋白群體移動模型，來解釋底物結合前后酶蛋白構象發(fā)生了巨大的變化[6-7]。另外一部分是共價修飾?，F(xiàn)在變構調節(jié)不僅僅限制于配體與受體的聯(lián)系，還把概念延伸到蛋白質的共價修飾如磷酸化，乙?；蛘呓宦?lián)。蛋白質的功能取決于不同構象狀態(tài)之間的平衡，這種平衡可以被許多調節(jié)蛋白質活性的外部因素改變，包括局部的干擾，如翻譯后修飾。細胞功能的調節(jié)可以通過多種機制完成，包括轉錄調節(jié)、選擇性剪切、翻譯調節(jié)、磷酸化和其他翻譯后共價修飾、降解、定位、蛋白質—蛋白質相互作用和小分子變構效應物[8]。近幾年來共價修飾的變構調節(jié)慢慢地成為了科學家們的研究熱點，小分子可以與蛋白質進行結合和共價修飾如磷酸化或者乙?；?，從而調控了不同蛋白質之間的動態(tài)平衡，因此在下文中我們將著重就蛋白質變構調節(jié)與翻譯后修飾展開論述。

1.小分子化合物的變構調節(jié)

在生物體中變構調節(jié)到底有多普遍呢？首先，變構是蛋白質和核酸分子感知細胞環(huán)境變化和維持細胞內環(huán)境穩(wěn)定的一種方式。其實是變構提供了一種能夠直接感知小分子水平的機制，它可以非常迅速，其擴散速率大約為108 M-1·s-1，并且很容易可逆。與磷酸化/去磷酸化等共價蛋白修飾的變化不同，變構信號轉導中細胞能量不會被消耗。第二，自40年研究以來，相當大比例的蛋白質被認為是可以變構調節(jié)的，而且盡管已知蛋白質的數(shù)量急劇增加，但是已知的變構調節(jié)蛋白的數(shù)量卻沒有增加?？茖W家們在40年前發(fā)現(xiàn)一種蛋白質所需要的努力，與目前發(fā)現(xiàn)一種變構小分子化合物所需要的努力是一樣的。如今，基因和蛋白質的發(fā)現(xiàn)是可以系統(tǒng)性對應起來的，但是效應小分子化合物的發(fā)現(xiàn)仍然是很稀少，因為這種變構小分子化合物的發(fā)現(xiàn)很耗費時間與精力，更為重要的是一般科學家們會在偶然間發(fā)現(xiàn)這種小分子，而且只有少數(shù)的科學家們愿意花時間與精力去挖掘這種小分子。所以一個變構小分子的發(fā)現(xiàn)是尤其值得科學家們繼續(xù)挖掘深入。

由于過去幾十年分子生物學技術的進步，我們對大多數(shù)這些變構機制的調控知識有了極大的擴展。這幾年來，小分子調節(jié)的變構相互作用逐漸被演繹為一種新穎的變構調節(jié)方式。這些小分子化合物可以直接介導兩個或多個蛋白相互作用，但是介導蛋白與蛋白相互作用的小分子是區(qū)別于那種結合受體的小分子，它是使用自然變構信號直接調節(jié)蛋白與蛋白相互作用的小分子。目前蛋白與蛋白相互作用（PPIs）網(wǎng)絡或作用體已經通過高通量雙酵母雜交技術定位到大約130000個，所以越來越多的文章涉及到變構調節(jié)參與到細胞生理和疾病中。變構調節(jié)發(fā)生在細胞膜，細胞質以及生命體的單個分子和多個蛋白復合體中，也會發(fā)生在DNA與DNA，DNA與蛋白的相互作用中。小分子變構引起的共價修飾如翻譯后修飾會讓蛋白質的三維結構發(fā)生變化，從而使蛋白質的功能在OFF到ON狀態(tài)之間進行切換，通過刺激細胞信號通路以及分支來影響到細胞生理狀態(tài)。綜上所述，小分子變構調節(jié)對于細胞的生命活動是如此的重要，但是目前對于變構如何作用于生物分子水平的機制尚未闡述清楚。

2.翻譯后修飾與動態(tài)變構調節(jié)

翻譯后修飾是真核細胞中特有的調控方式。至少有1/3的蛋白經歷著翻譯后修飾變化，翻譯后修飾可以調節(jié)一些信號通路中蛋白質的活性和轉錄因子結合底物DNA上來決定基因表達、細胞生長和分化。有些蛋白上會通過翻譯后修飾來抑制蛋白與蛋白之間的相互作用。比如說Bcl-xl蛋白是凋亡抑制基因，自身的兩條螺旋鏈（α1與α2）上擁有一些無序結構域IDRs，在一般情況下，Bclxl蛋白會與BH3蛋白結合從而增強其抗凋亡能力。在無序結構域上有幾個位點會發(fā)生修飾如S62被磷酸化和N52/N66被脫酰胺，這些位點的突變都使得無序結構域的中心區(qū)域與Bcl-xl蛋白折疊核心區(qū)域的精氨酸殘基結合引起構象改變，減少了Bcl-xl蛋白與BH3蛋白的親和力，使得蛋白質們相互分離，從而抑制了其抗凋亡活性[9-10]。另外，P27蛋白定位于細胞核中，它會與CDK2和Cyclin A結合從而抑制CDK2和Cyclin A活性，使細胞周期不能進行。但是即使結合，P27蛋白上有些區(qū)域仍然很靈活，Tyr88可以被非受體酪氨酸激酶Abl，Lyn，Src磷酸化，從而使P27蛋白釋放CDK2蛋白，促進了CDK2對P27蛋白的Thr187的磷酸化修飾。當P27蛋白的Tyr88和Thr187位點被磷酸化，則SCF泛素連接酶就會對P27蛋白進行泛素化修飾和被26S蛋白酶體降解，從而導致CDK2和Cyclin A與P27蛋白分離。游離態(tài)的CDK2和Cyclin A會慢慢積累，隨之加強了P27蛋白的Thr187位點的磷酸化，最終使細胞周期順利地從G1期過渡到S期，保證了正常的細胞周期運行[11-13]。

相反，有些蛋白會通過翻譯后修飾來促進與其他蛋白結合。比如說LAT蛋白可以被ZAP70蛋白酪氨酸磷酸化，招募下游信號分子如帶SH2結構域的Grab2蛋白來激活T-cell receptor。在這個過程中，從動力學上講ZAP70蛋白磷酸化LAT程度很低，但是LAT是一個無序蛋白，它在一些遠端的殘基上也可以酪氨酸磷酸化，隨著一連串的磷酸化反應，LAT蛋白構象開始伸展，與Grb2蛋白的結合能力越來越強，從而產生信號的放大。而且體外二維酶學實驗也揭示了Grab2與LAT的相互作用和LAT的酪氨酸磷酸化的數(shù)目相關，當LAT的磷酸化位點逐個突變成苯丙氨酸，LAT與Grab2的親和力越來越低[14-16]。

3.變構調節(jié)與藥物開發(fā)

變構是調節(jié)生物大分子功能最直接、最有效的途徑，從代謝機制的控制到信號轉導途徑。變構調制劑以變構位點為靶點，與以活性位點為靶點的正構配體相比，具有特異性強、副作用少、毒性低等明顯優(yōu)勢。變構調節(jié)劑作為一種潛在的治療藥物，在新藥的設計和開發(fā)中受到越來越多的關注。事實上，越來越多的變構調節(jié)抑制劑被FDA批準，慢慢進入臨床試驗階段。例如HSP70的變構調節(jié)是比較經典的。HSP70分子伴侶在應激環(huán)境下和生理狀態(tài)下發(fā)揮了巨大的作用。伴侶分子的活性需要其C末端底物結合域(SBD)與底物多肽短而疏水的肽段的短暫相互作用，而這種相互作用是通過N末端核酸結合域（NBD）來調節(jié)的。當在沒有核酸結合和ADP結合的狀態(tài)下，NBD與SBD兩個結構域是獨立的，它們之間只有一個高度保守的短鏈相連接。SBD由兩個亞結構域組成，SB口袋結構中的兩層beta三明治結構（SBDβ）和α螺旋的蓋子結構域相互交纏在一起，所以SBD對底物具有很高的親和力。一旦ATP結合上去，NBD兩條側鏈就會相互纏繞，SBD的兩個結構域就會分離，分別結合到NBD上去，導致底物結合率和解離率分別增加2到3個數(shù)量級，使底物親和力降低。ATP水解會使HSP70增加對底物的親和力，其中苯丙氨酸146位與ATP結合導致HSP70釋放了底物。針對這一機制，科學家們設計了抗癌藥物—MKT-077，它可以結合到HSP70的ADP結合位點上，干預蛋白與蛋白的相互作用，阻止NBD的loop222的運動，最終使乳腺癌細胞不能增殖[17-18]。

還有AKT(蛋白激酶B, PKB)是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，屬于AGC激酶家族。它被發(fā)現(xiàn)為小鼠白血病病毒AKT8致癌基因，在人類中由三個基因AKT1、2和3編碼。AKT家族成員影響多種生物學功能，包括細胞增殖生長、代謝、蛋白合成、遷移、血管生成和抗凋亡能力。為了讓AKT調節(jié)這些功能，其激活過程是必不可少的。AKT的充分激活需要轉位到質膜，然后其蘇氨酸308和絲氨酸473殘基同時被磷酸化，這兩個殘基的磷酸化被PI3K/AKT/mTOR通路中的多種蛋白調控[19-20]。在這個通路中，PI3K可以磷酸化磷脂酰肌醇(3,4)二磷酸(PIP2)到磷脂酰肌醇(3,4,5)三磷酸(PIP3)。PI3K依賴性激酶1 (PDK1)和AKT的同源(PH)域均與位于質膜的PIP3結合，從而使PDK1磷酸化AKT的Thr308位點。通過mTORC2/rictor復合物，AKT在疏水基序c端Ser 473處磷酸化，完成活化過程。一旦被激活，AKT磷酸化下游的靶蛋白，包括PRAS40、GSK3、FOXO和BAD[2]。另外，AKT還通過磷酸化TSC1和TSC2來抑制其抑制作用，從而激活mTORC1，最終導致4E-BP1和S6K磷酸化[21]。ARQ 092和下一代化合物ARQ 751是高選擇性的廣譜AKT抑制劑。鑒于AKT1-E17K突變的重要性，在癌癥和其他疾病中這種靶向突變可能成為ARQ 092和ARQ 751等AKT抑制劑的潛在位點。體外生化結合實驗表明，在納米級濃度下，ARQ 092和ARQ 751與AKT1-WT和AKT1-E17K突變體結合緊密一個ARQ 092的類似物的晶體結構，它們結合在激酶和PH域界面之間形成的變構口袋里[22-23]。ARQ 092不僅作為單一藥物，而且與其他藥物聯(lián)合應用于多種腫瘤模型中，具有較強的腫瘤生長抑制作用。

蛋白質—蛋白質相互作用(PPIs)因其在健康和疾病環(huán)境中的重要意義而成為具有廣泛治療價值的藥物靶點。因此，它們被廣泛認為是藥物開發(fā)的圣杯。從歷史上看，PPIs因其龐大、扁平、無口袋的結構而被認為是“不可用藥的”。目前對這些“棘手”靶點的藥物治療嘗試包括正構和變構方法。以往采用蛋白質療法和小分子等正位法的研究常常因難以直接定位PPI接口而導致藥物性能低下。隨著結構生物學的快速發(fā)展，變構調制器已經逐漸成為一種潛在的解決方案。變構囊位于PPI正構位點的遠端，其配體不需要與PPI配體競爭，有助于改善變構PPI調節(jié)劑的理化和藥理特性。因此，利用變構調節(jié)來調控PPIs被認為是未來PPI藥物開發(fā)的一個誘人策略。

4.結語

本文中所討論的變構調節(jié)是指小分子代謝物與一些酶結合后，使得一些酶的活性發(fā)生了改變，從而對細胞的生理功能產生了一些影響。變構調節(jié)中的共價修飾部分在腫瘤代謝中尤為重要，特別是在蛋白與蛋白相互作用、信號通路轉導等方面發(fā)揮了巨大的作用。最近發(fā)表的一系列論文表明，蛋白質或DNA的變構在進化或生理過程中發(fā)揮著各自的生物學作用。這種如突變、磷酸化以及在蛋白質或DNA結構的任何位置與小分子的反應，會導致構象的分布發(fā)生變化。變構結構的不可逆變化或變構開關的異常是引起疾病的原因。這些變構可能共享相似的信號通路，在疾病發(fā)展中形成網(wǎng)絡調控，可能為新藥提供有前景的治療選擇。因此，變構在基因調控中起著關鍵作用，可以作為開發(fā)疾病新療法的新選擇。