擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AGL47的原核表達(dá)與包涵體復(fù)性研究

喬 帥，王明鳳，楊文博，許 君，鄭文明

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002)

MADS是由4種蛋白質(zhì)因子MCM1(釀酒酵母)、AGAMOUS(擬南芥)、DEFICIENS(金魚草)和SRF(人類)的首寫字母構(gòu)成［1］.MADS-box家族基因編碼多種具有重要生物學(xué)功能的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子［2，3］.在植物中 MADS-box 基因調(diào)節(jié)根、葉、花和果實的發(fā)育，特別是在植物的花分生組織和花器官發(fā)育中具有不同形式的時空表達(dá)模式［4～6］.MADS-box基因廣泛分布于擬南芥、金魚草、矮牽牛、煙草、番茄和油菜等雙子葉植物以及玉米、水稻、小麥和高粱等單子葉植物中［7，8］;MADS-box 家族轉(zhuǎn)錄因子的功能涉及到植物生長發(fā)育的各個方面，決定著植物的產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆等多種農(nóng)藝性狀，MADS-box轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定對尋找MADS-box轉(zhuǎn)錄因子上下游的關(guān)鍵調(diào)控因子，并通過調(diào)控它們的表達(dá)來達(dá)到提高作物產(chǎn)量、品質(zhì)、抗逆性狀具有重要意義［9］.擬南芥基因組編碼MADS-box家族轉(zhuǎn)錄因子107 個，包括 5 個基因亞家族［10，11］.AGL47 是擬南芥第5條染色體上At5g55690基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，屬于 MADs-box 蛋白家族 Mβ 亞家族［12～15］.ROSA等［16］的研究結(jié)果顯示，擬南芥AGL47轉(zhuǎn)錄因子受到磷饑餓特異性正調(diào)控，極有可能在磷代謝中發(fā)揮關(guān)鍵性的作用.本研究利用表達(dá)載體pPET-28a在大腸桿菌中實現(xiàn)了AGL47融合蛋白的表達(dá)，但以包涵體的形式存在.通過對包涵體的純化，變性和復(fù)性后，初步獲得了可溶性目的蛋白，為進(jìn)一步研究AGL47轉(zhuǎn)錄因子的功能奠定了重要基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 材料

工程菌 E.coli DH5α 和 E.coli BL21(DE3)表達(dá)載體pET-28a由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實驗室保存;At5g55690全長CDS克隆pENTR-At5g5569 為前期研究構(gòu)建［14］.

限制性內(nèi)切酶BamHⅠ/XhoⅠ，T4 DNA連接酶、IPTG，蛋白質(zhì)分子量標(biāo)準(zhǔn)(低)購自TaKaRa公司;尿素購自Amersco公司;谷胱甘肽/還原型谷胱甘肽，DTT，甘油購自博興生物技術(shù)有限公司;pfu DNA聚合酶、DNA凝膠純化試劑盒購自TIANGEN公司.質(zhì)粒提取采用堿裂解法.

1.2 方法

1.2.1 PCR引物 根據(jù) At5g55690的 CDS序列設(shè)計PCR引物，P1引物引入BamHⅠ酶切位點，P2引物引入XhoⅠ酶切位點，由北京捷瑞生物技術(shù)有限公司合成，引物序列為:P1:5’-TAGGATCCATGGGTCGAA AGATGGTA-3’，P2:5’-CGCTCGAGCATAGAA AGTTTACTTGAATC-3’.

1.2.2 AGL47融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建 以pENTR-At5g55690質(zhì)粒為模板擴(kuò)增At5g55690的全長CDS，回收PCR產(chǎn)物，BamHⅠ和XhoⅠ雙酶切后與pET-28a定向連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，卡那霉素(Kanamycin，kan)抗性篩選陽性菌株.陽性菌株進(jìn)行菌落PCR、質(zhì)粒PCR和雙酶切鑒定，鑒定后的陽性克隆送上海博尚生物技術(shù)公司測序.重組質(zhì)粒命名為pET-28a-At5g55690.

1.2.3 融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá) 將pET-28a-At5g55690轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)，挑選單菌落接種于5 ml LB液體培養(yǎng)基(含kan 50 mg·L－1)的離心管中，37 ℃，220 r·min－1，振蕩培養(yǎng)過夜，次日按 1∶100(V/V)比例接種于含5 mL新鮮LB培養(yǎng)基(含kan 50 mg·L－1)的 15 mL離心管中，37 ℃，220 r·min－1振蕩培養(yǎng)，當(dāng)菌液 OD600值達(dá) 0.6 ～ 0.8時，取1 mL菌液做對照，其余4 mL菌液加入IPTG至培養(yǎng)基中，IPTG 濃度為1 mmol·L－1誘導(dǎo)4 h.取1 mL菌液于4℃，12 000 g離心5 min，收集菌體沉淀用5 μL PBS懸浮，加入50μL的2×SDS-PAGE上樣緩沖液，充分混勻，100℃煮沸至樣品不再呈黏稠狀，10%SDS-PAGE電泳檢測融合蛋白表達(dá)情況.另外3 mL菌液于4℃，12 000 g離心5 min，加入1 mL PBS(pH值為7.4)，超聲破碎菌體99×2 s間歇 5 s(冰浴).4 ℃，12 000 g離心20 min.取上清和沉淀，SDS-PAGE電泳鑒定蛋白的可溶性.

1.2.4 包涵體純化 誘導(dǎo)表達(dá)150 mL細(xì)菌培養(yǎng)物，離心收集表達(dá)菌體.在20 mL裂解緩沖液(10 mmol·L－1Tris-Cl pH 值為 8.8，50 mmol·L－1NaCl，1 mmol· L－1EDTA，5% 甘油，0.1 mmol·L-1DTT，1 mmol·L－1PMSF，2%Triton X-100)中超聲破碎后，離心收集沉淀.用洗脫緩沖液(2%Triton X －100，10 mmol·L－1Tris-Cl pH 值為 8.8，2.5mol· L－1NaCl，1mmol· L－1EDTA，0.1 mmol·L－1DTT)洗滌樣品 3 次，每次 250 mL;然后用重懸緩沖液(10 mmol·L－1Tris-Cl pH值為8.8，50 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1EDTA，0.1 mmol·L－1DTT，4 mol·L－1尿素，1 mmol·L－1PMSF，2%Triton X-100)洗滌1次，最后離心沉淀即為純化后的包涵體［17～20］.包涵體可以立即用于變性復(fù)性，也可以放置－70℃保存?zhèn)溆?

1.2.5 AGL47融合蛋白復(fù)性 蛋白質(zhì)復(fù)性采用透析復(fù)性法:將洗滌純化后的包涵體用20 mL增溶緩沖液(10 mmol·L－1Tris-C1 pH 值為 8.8，1 mmol·L－1EDTA，0.1 mmol·L－1DTT，6 mmol·L－1尿素，50 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1PMSF，5%甘油，2%Triton X-100)融解，超聲波助溶10×2 s間歇5 s至沉淀完全融解，冰浴2 h，中間不斷晃動均勻樣品確保包涵體融解完全.4℃，12 000 g離心30 min除去不融物和細(xì)胞碎片，變性液放置1 L復(fù)性緩沖液Ⅰ(10 mmol·L－1Tris-C1 pH值為8.8，0.1 mmol·L－1DTT，50 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1PMSF，5%甘油)中，透析復(fù)性 6 h，更換成1 L復(fù)性緩沖液Ⅱ(10 mmol·L－1Tris-C1 pH值為8.8，50 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1PMSF，5%甘油)，透析復(fù)性6 h;更換成1 L復(fù)性緩沖液Ⅲ(10 mmol·L－1Tris-C1 pH 值為 8.8，50 mmol·L－1NaCl，1 mmol·L－1PMSF，5% 甘油，1 mmol·L－1GSH，0.2 mmol·L－1GSSH)6 h 后更換復(fù)性緩沖液Ⅲ1 次，繼續(xù)透析至總透析時間為 24 h［18～20］.4℃，12 000 g離心30 min除去沉淀物，SDS-PAGE檢測復(fù)性蛋白純度及復(fù)性效果.

2 結(jié)果與分析

2.1 AGL47融合蛋白表達(dá)載體構(gòu)建

以pENTR-At5g55690質(zhì)粒為模板，以P1和P2為引物擴(kuò)增得到850 bp基因片段，BamHⅠ與XhoⅠ雙酶切后與原核表達(dá)載體pET-28a定向連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒(圖1和圖2).重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌DH5α，卡那霉素篩選陽性克隆，菌落PCR和質(zhì)粒PCR均獲得850 bp擴(kuò)增片段(圖3和圖4).雙酶切鑒定重組質(zhì)粒得到大約834 bp的外源插入片段，與預(yù)期大小相符(圖5).經(jīng)測序鑒定，重組質(zhì)粒的外源插入正確，重組質(zhì)粒命名為 pET-28a-At5g55690.

2.2 AGL47融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)

重組表達(dá)載體pET-28a-At5g55690轉(zhuǎn)化大腸桿菌 BL21(DE3)，用1 mmol·L－1IPTG 誘導(dǎo)融合蛋白表達(dá).SDS-PAGE結(jié)果顯示，誘導(dǎo)前融合蛋白沒有表達(dá)，誘導(dǎo)后融合蛋白開始表達(dá).但電泳結(jié)果表現(xiàn)為融合蛋白分布在3個條帶(圖6－A，B，C).其中A條帶約為35 kD，大小與完整AGL47融合蛋白大小相符;推斷B、C代表不同剪切本蛋白或不完整的AGL47融合蛋白，準(zhǔn)確序列尚待純化測序鑒定.空載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)后，沒有顯示出誘導(dǎo)效應(yīng)(圖6).

圖6 AGL47融合蛋白誘導(dǎo)表達(dá)Fig.6 Induced expression of AGL47 fusion protein in E.coli.

2.3 AGL47融合蛋白可溶性鑒定、復(fù)性及純化

AGL47融合蛋白溶解性鑒定結(jié)果顯示，誘導(dǎo)表達(dá)的目的蛋白以包涵體形式存在.純化復(fù)性后目的蛋白仍在相同的位置呈現(xiàn)A，B，C 3條帶，A帶為完整目標(biāo)融合蛋白，B，C帶存在說明可能不同剪切或不完整的蛋白亦存在于包涵體中(圖7).復(fù)性后透析袋內(nèi)沒有沉淀發(fā)生，說明目的蛋白以可溶的形式存在;復(fù)性后蛋白的SDS-PAGE結(jié)果顯示，純化后復(fù)性的蛋白中只有A，B，C 3條帶，說明包涵體純化成功，并初步獲得了可溶性目的蛋白(圖7).

3 討論

轉(zhuǎn)錄因子蛋白具有誘導(dǎo)表達(dá)和不穩(wěn)定的特點，在原核細(xì)胞中表達(dá)，由于表達(dá)速度非?？?，而且缺乏正常的折疊環(huán)境和輔助折疊因子，易于形成包涵體.本研究中AGL47融合蛋白以包涵體的形式存在，純化后SDS-PAGE仍呈現(xiàn)A，B，C 3條帶，說明該融合蛋白表達(dá)存在復(fù)雜情況，這種現(xiàn)象在轉(zhuǎn)錄因子的原核表達(dá)中經(jīng)常出現(xiàn)，可以通過進(jìn)一步純化獲得目標(biāo)蛋白［21］.本研究中A帶為完整目的蛋白，B，C帶蛋白準(zhǔn)確序列尚待進(jìn)一步鑒定.

運(yùn)用DNAMAN軟件分析AGL47蛋白質(zhì)氨基酸序列特征，顯示該蛋白等電點pI 7.8左右.因此，實驗中將變性復(fù)性緩沖液的pH值調(diào)至8.8，偏離AGL47蛋白的等電點，避免蛋白在等電點處析出.AGL47蛋白一共含有6個Cys，推測含有3對二硫健，這大大增加了蛋白復(fù)性時錯誤折疊的可能性.同時，不同多肽鏈之間二硫鍵的結(jié)合，使融合蛋白在復(fù)性時容易以沉淀的形式析出，從而造成復(fù)性失敗.在本實驗中，為了防止此現(xiàn)象的發(fā)生，成功獲得可溶性蛋白，在透析液中在復(fù)性前期加入DTT作為還原劑，阻止二硫鍵的形成;在透析復(fù)性后期，在透析液中加入GSH/GSSG組合以幫助融合蛋白的正確折疊［17～20］.

擬南芥基因組編碼1 800個以上的轉(zhuǎn)錄因子，最近幾年通過對擬南芥和水稻兩種模式植物的低磷芯片數(shù)據(jù)分析，發(fā)現(xiàn)植物對低磷反應(yīng)的適應(yīng)性調(diào)控機(jī)制主要發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平上，目前已經(jīng)分離鑒定到了多個發(fā)揮重要作用的低磷響應(yīng)轉(zhuǎn)錄因子［22，23］.本研究前期結(jié)果顯示擬南芥轉(zhuǎn)錄因子AGL47受磷脅迫的特異調(diào)控，缺磷誘導(dǎo)下轉(zhuǎn)錄水平提高64.2倍，極有可能在磷調(diào)控通路中發(fā)揮重要的作用［16］，本研究在原核細(xì)胞內(nèi)實現(xiàn)了AGL47蛋白的表達(dá)，為進(jìn)一步研究AGL47蛋白的結(jié)構(gòu)和轉(zhuǎn)錄活性及其在磷調(diào)控基因網(wǎng)絡(luò)中的作用奠定重要基礎(chǔ).

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