河南地區(qū)豬戊型肝炎病毒的檢測及基因序列分析

張小霞，許 鋒，梁振普，喬冠華

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州450002)

戊型肝炎(Hepatitis E，HE)是一種由戊型肝炎病毒(HEV)引起的急性傳染病，主要經(jīng)糞－口傳播.該疾病在公共衛(wèi)生體系不發(fā)達(dá)的地區(qū)較為流行，一般由水源污染引起大規(guī)模暴發(fā).戊型肝炎在熱帶和亞熱帶地區(qū)爆發(fā)嚴(yán)重，而發(fā)達(dá)國家主要以散發(fā)性病例為主［1～5］.HEV為無囊膜的正鏈 RNA 病毒，基因組全長約7.2 kb，包括5’端和3’端的非編碼區(qū)以及3個開放閱讀框架(ORFs).ORF1長約5.1 kb，編碼一些非結(jié)構(gòu)蛋白，如甲基轉(zhuǎn)移酶、依賴RNA的RNA聚合酶等;ORF2長約1.98 kb，編碼主要的結(jié)構(gòu)蛋白;ORF3較小，與ORF2有部分重疊［6］，編碼1個磷酸化蛋白，與細(xì)胞骨架相互作用［7］，并可能參與病毒從細(xì)胞中的釋放［8］.在ORF1和ORF2內(nèi)各有1段序列差異較大的區(qū)域，該區(qū)域是目前國際上通用的HEV基因分型依據(jù).HEV主要分為4個基因型，這些基因型有區(qū)域性分布特征.Ⅰ型分布較廣，主要分布在亞洲和非洲地區(qū);Ⅱ型主要分布在墨西哥;Ⅲ型分布最廣，在亞洲、歐洲、美洲以及大洋洲都有分布;Ⅳ型主要分布在亞洲.中國的HEV基因型主要是Ⅰ型和Ⅳ型［9～11］，但是陸一涵等［12］在上海地區(qū)也檢測到了Ⅲ型HEV病毒.HEV危害較大，對孕婦有較高的致死率.傳播途徑較多，給防治工作帶來了一定難度.越來越多的研究證實動物正成為HEV的主要傳播媒介［13］.HEV在豬群中廣泛存在，對生豬生產(chǎn)是一個不可忽視的隱患.本研究將通過對河南省部分地區(qū)豬群中的HEV進(jìn)行檢測，并進(jìn)行基因序列分析，為HEV的防控提供必要的理論依據(jù).

1 材料與方法

1.1 試驗樣品采集

133份豬血清采自河南省鄭州、洛陽、新鄉(xiāng)、焦作、周口等5個地市，存于－80℃待檢.200份糞便樣品分別從鄭州、中牟、新鄭、濟源、濮陽采集.其中，鄭州糞便樣品50份，中牟樣品50份，新鄭樣品30份，濟源樣品共40份，濮陽樣品30份.在各地市分別從豬欄里采集獨立的新鮮糞便樣品，低溫保存，存于－80℃待檢.

1.2 主要試劑

提取RNA用的RNAiso Plus，RNA酶抑制劑，Taq酶，dNTP購自大連寶生物公司.反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV購自Promega公司，DEPC(焦碳酸二乙酯)購自美國AMRESCO公司，膠回收試劑盒購自上海捷瑞公司.

1.3 菌種和克隆載體

菌種為大腸桿菌DH5a，克隆載體pMD-18T載體購自大連寶生物公司.

1.4 血清抗體檢測

血清抗體檢測試劑盒購自北京萬泰公司.血清抗體檢測嚴(yán)格按照試劑盒說明書進(jìn)行.

1.5 引物

HEV陽性樣品篩選所用的反轉(zhuǎn)錄和巢式PCR的引物及條件參照文獻(xiàn)［14］的方法;河南病毒株基因組3’末端序列克隆引物由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)實驗室參考序列比對設(shè)計，并由上海博尚公司合成.試驗所用引物序列見表1.

1.6 樣品處理和RNA提取

1.6.1 糞便樣品的處理 將1 g糞便樣品溶于DEPC 水配置的10 mL PBS(0.01 mol·L－1，pH 值為7.2～7.4)中.使用渦旋震蕩儀進(jìn)行混勻，4℃，8 000 r·min－1離心 8 min.取上清液 200 μL 進(jìn)行RNA提取.

表1 引物序列Table 1 Sequence of primers

1.6.2 RNA的提取 按照RNAiso Plus說明書提取RNA.

1.7 RT-PCR

按照反轉(zhuǎn)錄酶說明書完成反轉(zhuǎn)錄體系.反轉(zhuǎn)錄過程為:42℃ 60 min，95℃ 5 min.結(jié)束后迅速將管拿出置于冰上冷激2 min以上.反轉(zhuǎn)錄好的cDNA直接進(jìn)行PCR，或存于－80℃.巢式PCR條件及過程參照文獻(xiàn)［14］，將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測.

河南HEV病毒株3’端部分序列擴增條件如下:以oligo(dT)為反轉(zhuǎn)錄引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)，反轉(zhuǎn)步驟同上.然后用正向引物E和反向引物oligo(dT)進(jìn)行PCR擴增.PCR體系為25 μL.擴增條件如下:94℃預(yù)變性3 min，94℃變性1 min，44℃退火1 min，72℃延伸1 min，30個循環(huán)，最后72℃延伸10 min.將PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測.

1.8 目的基因的測序

根據(jù)陽性樣品的地域分布特點，將3個陽性樣品的巢式PCR產(chǎn)物(JY6，JY40和ZZ9)送至上海生工直接進(jìn)行測序.將JY40基因組3’末端約800 bp PCR產(chǎn)物膠回收純化后，連接到pMD-18T載體上轉(zhuǎn)化到DH5α，藍(lán)白斑篩選檢測后送到北京博尚生物公司進(jìn)行測序.

1.9 系統(tǒng)發(fā)育

將巢式PCR測序結(jié)果以及JY40基因組3’端804 bp序列測序結(jié)果通過軟件Clustal x和MEGA 4.0進(jìn)行比對，使用 Kimura-2-parameter法進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育分析.巢式PCR產(chǎn)物參照GeneBank中的30條序列(表2)進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析.

2 結(jié)果與分析

2.1 血清學(xué)檢測結(jié)果

用酶聯(lián)免疫試劑盒對分離到的血清進(jìn)行抗體檢測，發(fā)現(xiàn)不同地區(qū)抗體的陽性率不同，且沒有明顯的分布規(guī)律;部分地區(qū)的抗體陽性率高達(dá)100%，抗體陽性率最低也在61%以上(表3).這種結(jié)果可能和各地區(qū)采集的樣品總數(shù)有關(guān).經(jīng)過檢測，血清樣品中HEV抗體總陽性率達(dá)到79.70%.

表2 系統(tǒng)發(fā)育分析比較的序列Table 2 HEV strains used in the phylogenetic and sequence analyses

表3 血清樣品檢測結(jié)果Table 3 Results of serum detected

2.2 糞便樣品陽性率檢測結(jié)果

對200份樣品進(jìn)行RT-PCR，結(jié)果顯示，在鄭州采集的50份樣品中只有1個為陽性;在新鄭和中牟采集的80份樣品均為陰性;在濟源采集的40份樣品中8份樣品呈陽性;在檢測的30份濮陽樣品中6份樣品呈陽性.HEV RNA總體陽性率達(dá)到7.5%.檢測到的陽性樣品均能在1%的瓊脂糖凝膠上觀察到436bp的條帶，將PCR產(chǎn)物送往上海生工測序驗證.部分樣品的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果見圖1.

圖1 部分陽性糞便樣品檢測結(jié)果Fig.1 Result of some positive fecal sample tested

2.3 序列對比與分析

2.3.1 巢式PCR結(jié)果序列的對比與分析 將3個河南分離株的測序結(jié)果進(jìn)行序列同源對比(圖2)，結(jié)果顯示JY6與JY40同源性高達(dá)98%，與ZZ9同源性為84%;JY40與ZZ9同源性為83%.為進(jìn)一步研究3個河南分離株的基因型，將其與NCBI中收錄的部分Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型HEV的相應(yīng)核苷酸進(jìn)行對比(圖略).比對發(fā)現(xiàn)，3個河南分離株與HEVⅠ，Ⅱ，Ⅲ，Ⅳ型同源性分別為77% ～79%，74% ～76%，76% ～81%，79% ～86%.結(jié)果顯示，相對于Ⅰ，Ⅱ，Ⅲ型HEV而言，3個河南分離株與Ⅳ型HEV的同源性較高.

2.3.2 JY40 3’末端 826bp 序列的對比與分析為進(jìn)一步研究河南HEV病毒株的特點，克隆了JY40分離株3’端長約800 bp的序列.將測序后的病毒分離株 JY40 3’端序列去掉 polyA，命名為“HN-JY”.將其同國內(nèi)6個基因Ⅳ型代表株進(jìn)行同源對比.結(jié)果顯示，HN-JY與湖北分離株(WH09)同源性最高，達(dá)到95.3%;而與長春分離株(Ch-S-1)同源性最低，為84.1%.

圖2 3個河南分離株的核苷酸同源性分析Fig.2 Nucleotide sequence identity of the three Henan HEV strains

2.4 系統(tǒng)發(fā)育分析

使用表2中的相應(yīng)序列，對得到的HEV河南株進(jìn)行了系統(tǒng)發(fā)育分析(圖4).分析結(jié)果顯示，分離到的3個河南分離株都屬于Ⅳ型HEV.2個濟源株(JY6，JY40)屬于同一個亞型，鄭州株(ZZ9)屬于另一個亞型.

圖4 基于ORF2中核苷酸序列的系統(tǒng)發(fā)育分析Fig.4 Phylogenetic tree constructed by based nucleotide sequence of ORF2

3 小結(jié)與討論

1)中國豬群攜帶的HEV的基因型主要是Ⅰ型和Ⅳ型.陸一涵等［12］在上海地區(qū)檢測到了國內(nèi)首例Ⅲ型HEV病毒，說明在同一地區(qū)會有不同型別HEV病毒并存的可能.本研究對河南省部分地市豬群中的HEV抗體及病毒進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)HEV抗體的總陽性率達(dá)到79.70%，個別地方甚至達(dá)到100%，說明豬戊型肝炎病毒可能在河南省豬群中廣泛存在.經(jīng)過測序，篩選的3個河南分離株都為Ⅳ型.

2)HEV在感染動物的初期即可進(jìn)行傳播，使得傳統(tǒng)的疫苗并不能產(chǎn)生十分有效的作用.LORENZO等［15］發(fā)現(xiàn)HEV在體內(nèi)經(jīng)過傳代會產(chǎn)生突變，可能會通過這種途徑規(guī)避體內(nèi)免疫機制對病毒的破壞.這也可能降低HEV疫苗的作用.因此，應(yīng)建立完善的監(jiān)管體制，盡量避免戊型肝炎從豬群傳播到人，保障人民群眾的切身利益.

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