非掃描式光學(xué)SPR生物傳感器的數(shù)據(jù)分析

趙媛媛，肖 龍，朱 鶯，胡建東，江 敏，胡楓江，魏文松，李會(huì)芹

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)機(jī)電工程學(xué)院，河南鄭州450002;2.河南職業(yè)技術(shù)學(xué)院，河南鄭州450046;3.浙江省標(biāo)準(zhǔn)化研究院，浙江 杭州310006;4.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南 鄭州450002)

光學(xué)表面等離子共振(Surface plasomon resonance，SPR)生物傳感技術(shù)是一種多用途的分析平臺(tái)，廣泛應(yīng)用于非標(biāo)記、非破壞性、在線監(jiān)測(cè)生物分子動(dòng)態(tài)反應(yīng)，已在農(nóng)業(yè)、食品安全監(jiān)測(cè)、藥物篩選、臨床醫(yī)學(xué)診斷及環(huán)境監(jiān)測(cè)等領(lǐng)域得到越來(lái)越廣泛的應(yīng)用［1～3］.在光學(xué)SPR 檢測(cè)系統(tǒng)中，來(lái)自光源和檢測(cè)系統(tǒng)噪聲以及環(huán)境溫度、機(jī)械振動(dòng)等帶來(lái)的信號(hào)抖動(dòng)都會(huì)使理想信號(hào)受到噪聲和失真的干擾.因此，為了提高儀器的檢測(cè)性能，使其具有高靈敏度和高穩(wěn)定性，不但要優(yōu)化儀器系統(tǒng)硬件，還要選擇相應(yīng)的信號(hào)處理方法，最佳的數(shù)據(jù)處理方法可有效的降低測(cè)量過(guò)程中隨機(jī)噪聲和系統(tǒng)不理想所造成的影響，可以大大提高測(cè)量系統(tǒng)的準(zhǔn)確度和數(shù)據(jù)的精度［4～6］.數(shù)據(jù)分析方法能夠使光學(xué)表面等離子共振生物傳感系統(tǒng)得到一些高精度的信息，用來(lái)推算實(shí)際生物分子動(dòng)態(tài)反應(yīng)過(guò)程中所發(fā)生的現(xiàn)象，從而用來(lái)引導(dǎo)新的SPR傳感系統(tǒng)的設(shè)計(jì)以達(dá)到最大分辨率［7～9］.通常，從數(shù)據(jù)采集系統(tǒng)采集到的數(shù)據(jù)是被測(cè)目標(biāo)的某些物理量經(jīng)過(guò)傳感器的轉(zhuǎn)換，再經(jīng)過(guò)放大或衰減等環(huán)節(jié)之后所呈現(xiàn)出來(lái)的一種數(shù)據(jù)形式.由于設(shè)備性能的不理想，以及外界干擾、噪聲的影響，都會(huì)在采集到的數(shù)據(jù)中引入一定的噪聲或干擾，因而數(shù)據(jù)處理的一個(gè)重要任務(wù)就是要采取各種方法最大限度地消除這些噪聲，以盡可能提供數(shù)據(jù)的精確度［10，11］.目前 SPR的數(shù)據(jù)處理方法主要有質(zhì)心跟蹤法、一階導(dǎo)數(shù)零點(diǎn)法、多次測(cè)量求平均等處理方法.質(zhì)心追蹤法是以SPR曲線的最小點(diǎn)為中心，采用內(nèi)插值的方法，分別向左、右選擇相同數(shù)量的點(diǎn)，從而確定要計(jì)算的數(shù)據(jù)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，再采用一階矩的公式計(jì)算［12，13］.該方法的優(yōu)點(diǎn)在于可以減少噪音信號(hào)對(duì)儀器的干擾，且可以應(yīng)用于非對(duì)稱的SPR曲線，但對(duì)于線陣CCD來(lái)說(shuō)，各個(gè)像素間是相互獨(dú)立的，這種方法限制了非掃描分析儀的動(dòng)態(tài)范圍，增大了系統(tǒng)的誤差.一階導(dǎo)數(shù)零點(diǎn)法是通過(guò)尋找數(shù)據(jù)的一階導(dǎo)數(shù)零點(diǎn)位置來(lái)確定最低點(diǎn)，由于最低點(diǎn)處的信號(hào)強(qiáng)度較小，受噪聲影響較大，影響準(zhǔn)確性.多次測(cè)量求平均可以有效的抑制噪聲，但卻會(huì)降低靈敏度.作者提出了多項(xiàng)式擬合和質(zhì)心法相結(jié)合的處理方法.首先對(duì)采集到的數(shù)據(jù)進(jìn)行滑動(dòng)平均濾波處理，計(jì)算基線來(lái)確定處理數(shù)據(jù)的范圍，在這個(gè)范圍內(nèi)利用多項(xiàng)式擬合對(duì)SPR曲線進(jìn)行處理，然后通過(guò)質(zhì)心法計(jì)算最低點(diǎn)值所對(duì)應(yīng)的像素位點(diǎn)，這種方法在一定程度上提高了數(shù)據(jù)處理的精度和靈敏度.

1 非掃描光學(xué)生物傳感器

非掃描式光學(xué)SPR生物傳感器的結(jié)構(gòu)示意圖如圖1所示，該光學(xué)SPR生物傳感器主要由光源、光學(xué)SPR芯片和CCD光電檢測(cè)器3部分組成.光源由一字線型激光器(波長(zhǎng)650 nm)和光學(xué)P偏振片組成，光學(xué)SPR芯片由端面蒸鍍有50 nm金膜的光學(xué)直角棱鏡和微流通池組成，CCD光電檢測(cè)器由2 048個(gè)像素的線陣CCD和信號(hào)采集器組成.

非掃描性角度調(diào)制型光學(xué)SPR生物傳感器，入射光波長(zhǎng)不變，將一字線型激光器發(fā)出的激光光束以一定角度穿過(guò)直角棱鏡入射到棱鏡與金膜的界面，光線從該界面產(chǎn)生全反射，CCD數(shù)據(jù)采集器會(huì)接收從棱鏡端面反射回來(lái)的光強(qiáng)信號(hào)，并通過(guò)USB接口傳給上位機(jī)以實(shí)時(shí)獲得光學(xué)SPR共振響應(yīng)曲線.

圖1 光學(xué)SPR生物傳感器結(jié)構(gòu)Fig.1 A schematic structure of an optical SPR biosensor

圖1中激光束通過(guò)P偏振片照射到直角棱鏡，在棱鏡的端面形成一字線形光譜.試驗(yàn)時(shí)，在金膜上壓上微流通池，其通道與金膜的長(zhǎng)邊平行，打開(kāi)激光器，觀察一字線形光譜，把微流通池的通道完全覆蓋光譜.用蠕動(dòng)泵控制流通池中樣品的進(jìn)出，進(jìn)樣后，調(diào)整激光器位置，入射光照射到CCD上時(shí)形成直線型光斑，由于全反射現(xiàn)象，必然有某一角度的入射光，圖1中所示粗光線，是發(fā)生光學(xué)表面等離子波共振時(shí)光譜位置，在CCD檢測(cè)器上表現(xiàn)為光強(qiáng)最低點(diǎn)，上位機(jī)顯示該共振曲線.

2 共振光譜信號(hào)處理算法

由于光學(xué)SPR芯片靈敏度很高，獲得的信號(hào)或多或少的會(huì)受到外界信號(hào)的干擾，因此在采集SPR光學(xué)信號(hào)時(shí)，要對(duì)采集到的信號(hào)進(jìn)行預(yù)處理，此階段多采用濾波處理，本研究采用的是滑動(dòng)平均值濾波的方法，該方法主要用于采樣速度較慢或要求數(shù)據(jù)計(jì)算較高的實(shí)時(shí)系統(tǒng)，因此適宜用于SPR采集系統(tǒng).每條光學(xué)SPR曲線反應(yīng)的是N個(gè)像素所對(duì)應(yīng)的光強(qiáng)，然后分析完整的SPR曲線來(lái)確定樣品層的厚度，樣品層厚度的改變會(huì)引起反射光譜衰減特征的改變，從而光學(xué)SPR曲線不同.光學(xué)響應(yīng)值表示為{y［j］}，j=1，2，…，2 048，像素位點(diǎn)為x={xi，i=0，…，N}.設(shè)取樣 1 組測(cè)量數(shù)據(jù)，在上位機(jī)中設(shè)置N個(gè)取樣點(diǎn)的存儲(chǔ)空間，取樣值則為y1，y2，y3，…，yN，N 作為滑動(dòng)窗口，如果把數(shù)組 N+1處的值作為第j點(diǎn)的響應(yīng)值，那么j點(diǎn)的平均值pj=，因此上位機(jī)顯示的SPR共振曲線的每點(diǎn)響應(yīng)點(diǎn)都是滑動(dòng)平均后的值.

然后采用多項(xiàng)式擬合方法對(duì)最低點(diǎn)附近區(qū)域進(jìn)行數(shù)據(jù)擬合，然后利用質(zhì)心法求解SPR曲線的最低點(diǎn).給定數(shù)據(jù)序列(xi，yi)，i=1，2，…，m［16］，以二次項(xiàng)擬合為例.

擬合函數(shù)與數(shù)據(jù)序列的均方誤差

由多元函數(shù)的極值原理，Q(a0，a1，a2)的極小值滿足

整理得二次多項(xiàng)式函數(shù)擬合的法方程

非掃描式光學(xué)SPR生物傳感器獲得是二維數(shù)據(jù)，線陣CCD的每個(gè)像素是獨(dú)立存在的，像素位點(diǎn)和光學(xué)響應(yīng)值一一對(duì)應(yīng)，并都為已知量，因此可以計(jì)算出系數(shù)a0，a1，a2的值，多項(xiàng)式的階數(shù)越高，計(jì)算就越復(fù)雜.研究采用的CCD為2 048個(gè)像素，數(shù)據(jù)量大，可設(shè)定適當(dāng)?shù)那€擬合范圍以屏蔽掉測(cè)量分析時(shí)沒(méi)有用到的位點(diǎn)數(shù)據(jù)，減小計(jì)算量.光學(xué)SPR共振信號(hào)的最低點(diǎn)是通過(guò)質(zhì)心法來(lái)求解獲得的，質(zhì)心法是一種幾何形心求解的物理方法.在求解對(duì)稱的SPR曲線的最低點(diǎn)位點(diǎn)時(shí)，首先需要確定1條基線，用基線和SPR曲線交點(diǎn)范圍內(nèi)的數(shù)據(jù)點(diǎn)作為檢測(cè)點(diǎn)，基線確定方法的公式為

式中:Pb表示基線值，Pmax和Pmin分別表示SPR信號(hào)響應(yīng)值的最大值和最小值.

為了計(jì)算方便基線通常選取SPR曲線共振峰深度的半值左右.它與SPR曲線的交點(diǎn)確定需要計(jì)算數(shù)據(jù)位點(diǎn)的起點(diǎn)和終點(diǎn)，計(jì)算SPR曲線的一階矩的值.

式中:Ci表示所求SPR曲線與基線相交所得圖形的幾何形心，m，n分別表示基線與SPR曲線的2個(gè)交點(diǎn)，作為積分區(qū)間，i表示SPR曲線的相位點(diǎn)，Pi表示SPR信號(hào)的最低響應(yīng)值所對(duì)應(yīng)的像素位點(diǎn).因此，采用一階距法計(jì)算幾何形心時(shí)，Pb值的選擇非常重要，如果Pb值選取較小，雖然并不能改變共振峰的位置.但是，通常減小Pb會(huì)減少計(jì)算點(diǎn)的個(gè)數(shù)，從而增大噪聲對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響.

3 試驗(yàn)方法與數(shù)據(jù)處理

3.1 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用的試劑為不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇，把試驗(yàn)平臺(tái)放置于暗箱中，減小外來(lái)光線和電磁信號(hào)干擾.試驗(yàn)步驟如下:(1)固定一字線型激光器和線陣CCD，使入射至每個(gè)像素位點(diǎn)的入射光束和反射光束的光程相加相等，流通池完全覆蓋金膜，用蠕動(dòng)泵抽取少量的乙醇溶液.(2)旋轉(zhuǎn)調(diào)整激光器，使激光光束通過(guò)全反射后照到CCD表面，此時(shí)通過(guò)上位機(jī)觀察獲得的光學(xué)SPR曲線.(3)觀察光學(xué)SPR曲線是否出現(xiàn)最低點(diǎn)，即要尋找共振角，如無(wú)則繼續(xù)調(diào)整激光器或CCD的位置，直至獲得理想的光學(xué)SPR共振曲線為止.通過(guò)對(duì)不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證表面等離子生物分析儀的靈敏度.

首先依次流入微流通池體積分?jǐn)?shù)13%，14%，16%，17%，18%，19%的乙醇溶液分別試驗(yàn)，觀察上位機(jī)上的光學(xué)SPR共振曲線，待每個(gè)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液流過(guò)微流通池至信號(hào)穩(wěn)定再讀數(shù)，其中每完成1個(gè)體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液測(cè)定后均用去離子水沖洗金膜表面進(jìn)行再生，使傳感器能夠連續(xù)測(cè)量.

3.2 數(shù)據(jù)處理

依照上述試驗(yàn)方法，可以獲得乙醇溶液的光學(xué)SPR共振曲線.體積分?jǐn)?shù)為13%的乙醇溶液光學(xué)SPR共振曲線見(jiàn)圖2.其他體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液采用相同的方法，求出了其最低點(diǎn)值所對(duì)應(yīng)的像素位點(diǎn).

圖2 體積分?jǐn)?shù)為13%的乙醇溶液光學(xué)SPR共振響應(yīng)數(shù)據(jù)點(diǎn)和擬合曲線Fig.2 The optical SPR original data points and fitting curve of ethanol at volume fraction 13%

圖2中的數(shù)據(jù)點(diǎn)為經(jīng)滑動(dòng)平均值濾波后實(shí)時(shí)顯示的數(shù)據(jù)，實(shí)線表示的是在一定范圍內(nèi)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行多項(xiàng)式擬合后的結(jié)果.以體積分?jǐn)?shù)為13%的乙醇溶液為例，根據(jù)公式(5)可設(shè)定基線約為2 500，此時(shí)基線與SPR實(shí)測(cè)光學(xué)響應(yīng)共振曲線的交點(diǎn)分別為450和1 400，在這個(gè)區(qū)間內(nèi)對(duì)響應(yīng)曲線進(jìn)行多項(xiàng)式擬合，由于像素位點(diǎn)和光學(xué)響應(yīng)值為已知量，因此根據(jù)公式(3)和(4)可計(jì)算出多項(xiàng)式的系數(shù)，進(jìn)而得到擬合曲線公式，并在此區(qū)間內(nèi)，利用質(zhì)心法求取擬合曲線的最低點(diǎn)值所對(duì)應(yīng)的像素位點(diǎn).其他體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶液采用相同的算法，最后求得的體積分?jǐn)?shù)為 13%，14%，16%，17%，18%，19%的乙醇溶液所對(duì)應(yīng)共振像素位點(diǎn)值分別為862.05，856.10，842.21，821.57，814.70，808.00.

光學(xué)生物傳感器的靈敏度是指被測(cè)乙醇體積分?jǐn)?shù)的變化相對(duì)于光學(xué)響應(yīng)最低值的變化，靈敏度分析可以反映生物傳感器的性能，也反映了光學(xué)芯片的敏感度，由得到的共振像素位點(diǎn)值可以看出，光學(xué)響應(yīng)最低點(diǎn)所對(duì)應(yīng)像素位點(diǎn)值(OP)隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)(V)的增加而減小.

圖3中的數(shù)據(jù)點(diǎn)表示的是不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液所對(duì)應(yīng)的共振像素位點(diǎn)，光學(xué)響應(yīng)最低點(diǎn)所對(duì)應(yīng)像素位點(diǎn)值與不同體積分?jǐn)?shù)乙醇溶液的關(guān)系見(jiàn)圖3.從圖3可以看出，二者之間存在一定的線性關(guān)系，對(duì)二者進(jìn)行線性擬合，其方程為OP=989.24－959.60V，相關(guān)系數(shù)為 －0.985 2，靈敏度可達(dá)959.60(像素位置/體積分?jǐn)?shù)).由此看出兩者之間存在較好的線性關(guān)系，從而證明多項(xiàng)式擬合算法在處理非掃描式光學(xué)SPR生物傳感器數(shù)據(jù)上具有一定的優(yōu)越性.

圖3 乙醇溶液光學(xué)響應(yīng)最低點(diǎn)對(duì)應(yīng)像素位點(diǎn)與其體積分?jǐn)?shù)之間的關(guān)系Fig.3 The pixel position corresponds optical resonance dip-value as a function of ethanol volume fraction

4 結(jié)論

本研究提出了一種多項(xiàng)式擬合算法對(duì)自行設(shè)計(jì)的一種新型的光學(xué)SPR生物傳感器進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，首先采用滑動(dòng)平均值法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行濾波，然后采用最小二乘法求得多項(xiàng)式擬合系數(shù)，用來(lái)求解SPR傳感系統(tǒng)參數(shù).該方法可以快速實(shí)現(xiàn)光學(xué)SPR生物傳感器的共振最低點(diǎn)的求解.通過(guò)對(duì)體積分?jǐn)?shù)分別為13%，14%，16%，17%，18%，19%的乙醇溶液進(jìn)行檢測(cè)，用多項(xiàng)式擬合對(duì)一定區(qū)間內(nèi)的數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，再用質(zhì)心法計(jì)算擬合曲線的最低點(diǎn)值所對(duì)應(yīng)的像素位點(diǎn).試驗(yàn)結(jié)果表明，該方法可以使光學(xué)SPR生物傳感器獲得靈敏度可達(dá)959.60，為光學(xué)SPR的廣泛應(yīng)用以及大量測(cè)量數(shù)據(jù)的處理提供了依據(jù).

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