豬IgGⅡB類Fc受體剪接異構(gòu)體胞外區(qū)及結(jié)構(gòu)域的原核表達(dá)與抗體制備

劉肖萍，張志遠(yuǎn)，劉玉松，趙 琳，范 旭，徐紅運(yùn)，張鳳華，夏平安，崔保安

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南鄭州450002)

Fc受體(FcR)是特異親和免疫球蛋白(Ig)Fc片段的細(xì)胞表面分子，廣泛表達(dá)于效應(yīng)細(xì)胞和免疫輔助細(xì)胞表面［1］，屬于 Ig基因超家族成員.Fc受體通過與Ig Fc區(qū)域結(jié)合，參與Ig介導(dǎo)的生理功能或病理?yè)p傷過程，它不僅賦于免疫細(xì)胞殺傷病毒與細(xì)菌、清除免疫復(fù)合物、溶解癌變細(xì)胞的能力，而且參與免疫反應(yīng)的啟動(dòng)與調(diào)節(jié)，在免疫防御中發(fā)揮非常重要的作用［2］.

人的 FcγR 有 FcγRI，F(xiàn)cγRII，F(xiàn)cγRIII共3 個(gè)亞群，小鼠的 FcγR 有 FcγRI，F(xiàn)cγRII，F(xiàn)cγRIII，F(xiàn)cγRIV共4個(gè)亞群，每一個(gè)亞群都存在幾種亞類和不同的RNA剪接異構(gòu)體.FcγR在功能上可以分為活化性受體和抑制性受體.前者大都通過偶聯(lián)含有免疫受體酪氨酸激活基序ITAM的γ二聚體傳遞活化信號(hào);后者則主要通過自身分子胞漿區(qū)的免疫受體酪氨酸抑制基序ITIM傳導(dǎo)抑制信號(hào).FcγRIIB作為目前唯一發(fā)現(xiàn)的抑制性FcγR，在天然免疫和適應(yīng)性免疫反應(yīng)的負(fù)性調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用［3］.從豬體內(nèi)分離到的 Fc 受體有 FcγRI，F(xiàn)cγRII，F(xiàn)cγRIII 3 個(gè)亞群［4～6］.豬的 FcγRIIB(swFcγRIIB)氨基酸序列與人、鼠的相比較，有高度的同源性，胞內(nèi)區(qū)都含有1個(gè)保守的ITIM抑制基序.推斷豬FcγRIIB可能有相似的抑制功能［5］.QIAO 等［5］克隆并鑒定了swFcγRIIB受體，其胞外區(qū)含有 2個(gè) Ig結(jié)構(gòu)域(EC1，EC2).劉玉松等［7，8］隨后發(fā)現(xiàn)其存在 RNA剪接異構(gòu)體 swFcγRIIB1(GenBank accession No.FJ608551)，與 swFcγRIIB受體相比，胞內(nèi)區(qū)有57個(gè)堿基的插入，為了進(jìn)一步研究swFcγRIIB1各結(jié)構(gòu)域的生物學(xué)功能及其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制，本研究表達(dá)了 swFcγRIIB1 胞外區(qū) swFcγRIIB1-EY，EC1 結(jié)構(gòu)域swFcγRIIB1-AY 和 EC2結(jié)構(gòu)域 swFcγRIIB1-BY 融合蛋白.并對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行純化，用3種純化蛋白分別免疫小鼠，制備抗3種融合蛋白多克隆抗體，經(jīng)Western blot檢測(cè)證實(shí)制備的多抗可以與各自的融合蛋白特異性結(jié)合，表明制備的多抗具有高度特異性.從而為進(jìn)一步研究swFcγRIIB RNA剪接異構(gòu)體swFcγRIIB1結(jié)構(gòu)、功能和免疫特性奠定了基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 質(zhì)粒與菌株

豬 FcγRIIB1 克隆載體 pTG19-T-swFcγRIIB1，原核表達(dá)載體pET-32a，宿主菌 DH5α，BL21均由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)研究室保存.

1.2 主要試劑

T4 DNA連接酶、rTaq酶、限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ，EcoRⅠ購(gòu)自大連寶生物公司，IPTG，DAB顯色試劑盒，尿素購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG為北京博奧森生物技術(shù)公司產(chǎn)品，DNA膠回收純化試劑盒購(gòu)自北京百泰克生物技術(shù)有限公司，酶標(biāo)板購(gòu)自華美生物工程公司.硝酸纖維素膜(NC膜)購(gòu)自大連寶生物工程有限公司.

1.3 引物設(shè)計(jì)

通過分析swFcγRIIB1基因序列，應(yīng)用Premier軟件，分別設(shè)計(jì)3對(duì)引物并在引物兩端加入KpnⅠ和EcoRⅠ酶切位點(diǎn).上述引物由上海博瑞生物公司合成.

表1 擴(kuò)增swFcγRⅡB1胞外區(qū)及結(jié)構(gòu)域引物序列Table 1 The sequences of swFcγRⅡB1 and primers used in amplifying extracellular domain and structural domains

1.4 重組原核表達(dá)載體的構(gòu)建

以pTG19-T-swFcγRIIB1為模板，設(shè)計(jì)3對(duì)引物擴(kuò)增目的片段.反應(yīng)條件為:95℃預(yù)變性5 min，PCR循環(huán)為95℃ 45 s，退火溫度55.8℃ 45 s，72℃ 45 s，30個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)切膠回收，用KpnⅠ和EcoRⅠ雙酶切后連接至pET-32a載體中，按常規(guī)方法［9］轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，并涂布于瓊脂平板培養(yǎng)，挑取陽(yáng)性菌落，進(jìn)行PCR鑒定，酶切鑒定及序列測(cè)定，篩選陽(yáng)性重組表達(dá)質(zhì)粒 pET-EY，pET-AY，pET-BY.

1.6 融合蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)

將重組質(zhì)粒pET-EY，pET-AY，pET-BY轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21感受態(tài)細(xì)胞，在轉(zhuǎn)化平皿中挑取單個(gè)菌落，37℃振蕩培養(yǎng)16 h，將培養(yǎng)物以1∶100的稀釋度接種于含終質(zhì)量濃度為100 mg·L－1氨芐青霉素新鮮LB液體培養(yǎng)基中，于37℃振蕩培養(yǎng)至OD600達(dá)到為0.5～1.0時(shí)，分別加入不同終濃度的IPTG(0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 nmol·L－1)和進(jìn)行不同時(shí)間(2，3，4，5，6，7 h)的誘導(dǎo)表達(dá)，同時(shí)設(shè)立重組質(zhì)粒和空載體未誘導(dǎo)，空載體誘導(dǎo)和BL21對(duì)照.然后收取表達(dá)產(chǎn)物通過12%的SDS-PAGE電泳檢測(cè)融合蛋白的表達(dá)量，以確定 swFcγRIIB1-EY，swFcγRIIB1-AY，swFcγRIIB1-BY 融合蛋白的最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件.

1.7 涵體的制備、洗滌與純化

按最佳誘導(dǎo)表達(dá)條件誘導(dǎo)表達(dá)基因工程重組菌500 mL，離心收集菌體，按每克濕菌沉淀加入約3 mL 50 mmol·L－1PBS(pH 值為 8.0)懸浮菌體，反復(fù)凍融10次，加入終質(zhì)量濃度為100 mg·L－1溶菌酶，混勻后冰浴10 min，然后4℃作用30 min.隨后在冰浴中進(jìn)行超聲波處理，每次超聲處理4 s，間隔10 s，共作用80～100次，加入終質(zhì)量濃度為10 mg·L－1DNase，作用至菌液不再粘稠.按參考文獻(xiàn)［10］提供方法進(jìn)行包涵體的洗滌與純化.

1.8 包涵體的復(fù)性

將溶解的上清裝入已處理的透析袋內(nèi)，置于復(fù)性緩沖液中在4℃下進(jìn)行梯度透析，復(fù)性緩沖液中尿素濃度依次遞減 4，3，2，1，0.5，0 mol·L－1，換液間隔時(shí)間為10～12 h.之后將其置于雙蒸水中4℃攪拌過夜.

1.9 抗融合蛋白多克隆抗體的制備

選取6周齡雄性小白鼠60只，隨機(jī)分為3組，每組20只(試驗(yàn)組10只和對(duì)照組10只).試驗(yàn)組分別以3種純化的融合蛋白為抗原，按體積比1∶1混合弗氏完全佐劑皮下注射進(jìn)行初次免疫，抗原量為120 μg·只－1.初免后免疫佐劑改為弗氏不完全佐劑，每2周免疫1次，共免疫2次，對(duì)照組免疫佐劑不加融合蛋白，免疫程序同試驗(yàn)組.

1.10 ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體效價(jià)

采用方陣滴定法確定3種融合蛋白抗原的包被濃度以及陰、陽(yáng)性血清的最佳工作濃度，通過優(yōu)化包被時(shí)間、封閉液及其作用時(shí)間，酶標(biāo)二抗稀釋度及作用時(shí)間，根據(jù)結(jié)果確定最佳反應(yīng)條件［11］，ELISA檢測(cè)小鼠血清抗體.

1.11 融合蛋白的免疫活性檢測(cè)

按常規(guī)方法進(jìn)行Western blot分析［12］，應(yīng)用所制的鼠源抗3種融合蛋白的抗體和HRP標(biāo)記的羊抗鼠IgG檢測(cè)融合蛋白的免疫學(xué)活性.同時(shí)設(shè)空白載體誘導(dǎo)產(chǎn)物，BL21對(duì)照.

2 結(jié)果與分析

2.1 目的片段擴(kuò)增

分別利用3對(duì)引物通過 PCR方法從載體pTG19-T-swFcγRIIB1分別擴(kuò)增胞外區(qū)，EC1結(jié)構(gòu)域和EC2結(jié)構(gòu)域，擴(kuò)增的片段大小分別為432，183，162 bp，結(jié)果分別見圖1～圖3.

2.2 重組表達(dá)質(zhì)粒的鑒定

分別將編碼swFcγRⅡB1胞外區(qū)及EC1結(jié)構(gòu)域、EC2結(jié)構(gòu)域的DNA亞克隆到pET32a表達(dá)載體的T7啟動(dòng)子下游，提取重組表達(dá)質(zhì)粒pET-EY，pET-AY，pET-BY用PCR鑒定，擴(kuò)出了預(yù)期條帶.用KpnⅠ，EcoRⅠ酶切鑒定，分別得到了與預(yù)期結(jié)果相附的2個(gè)片段(圖4～圖6).測(cè)序分析表明，成功構(gòu)建了pET-EY，pET-AY，pET-BY 3種質(zhì)粒.

2.3 融合蛋白的表達(dá)及純化

swFcγRIIB1-EY，swFcγRIIB1-BY，swFcγRIIB1-AY融合蛋白分別含有144，61，54個(gè)氨基酸，分子量約為36，29，27 kD.表達(dá)產(chǎn)物均以包涵體形式存在，經(jīng)12%SDS-PAGE，與預(yù)計(jì)大小一致.誘導(dǎo)6 h表達(dá)量最高，swFcγRIIB1-EY，swFcγRIIB1-BY 融合蛋白以終濃度為1.0 mmol·L－1的IPTG誘導(dǎo)表達(dá)效果最佳，swFcγRIIB1-AY 融合蛋白為 0.8 mmol·L－1.融合蛋白經(jīng)提取與純化后所占菌體蛋白百分比可提升到85%.結(jié)果見圖7～圖9.

圖7 重組質(zhì)粒pET-EY在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.7 Expression of the recombinant plasmid pET-EY

圖8 重組質(zhì)粒pET-AY在大腸桿菌中的表達(dá)Fig.8 Expression of the recombinant plasmid pET-AY

2.4 抗融合蛋白鼠源抗體效價(jià)

ELISA方法檢測(cè)獲得的3種鼠源血清，結(jié)果顯示其血清中含有較高活性的特異性抗體.3種融合蛋白免疫抗體效價(jià)分別達(dá)到1∶5 120，1∶5 120，1∶10 240.

2.5 Western blotting 分析

經(jīng)Western blot分析，3種融合蛋白分別在36，29，27 kD處出現(xiàn)特異性條帶，而pET-32a空載體及BL21對(duì)照未出現(xiàn)特異性條帶，證實(shí)表達(dá)的融合蛋白與制備的鼠源抗體具有較好的反應(yīng)原性(圖10～圖12).

圖12 swFcγRIIB1-BY融合蛋白Western blot分析Fig.12 Western blot analysis of the recombinant protein swFcγRIIB1-BY

3 小結(jié)與討論

目前已知的抑制性受體有30多種，按結(jié)構(gòu)特征可分為2類:一類屬 C型凝集素超家族(CL SF)，屬Ⅱ型跨膜蛋白，主要包括Ly49家族，NKG2家族和 DCIR等.另一類為免疫球蛋白超家族(IgSF)，大多屬于Ⅰ型跨膜蛋白，主要包括FcγRIIB，Ig樣轉(zhuǎn)錄物(ILT)、信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白(SIRP)等［13］.FcγRIIB 屬于 I型跨膜蛋白，胞內(nèi)區(qū)含有一個(gè)ITIM酪氨酸抑制基序，F(xiàn)cγRIIB和其他含有ITAM的活化性受體交聯(lián)時(shí)，胞內(nèi)區(qū)的ITIM發(fā)生酪氨酸磷酸化后可以結(jié)合SHP-1，SHP-2，SHIP等具有2個(gè)串聯(lián)SH2結(jié)構(gòu)域的蛋白酪氨酸磷酸酶，并通過后者傳遞抑制信號(hào)，在免疫細(xì)胞的自我負(fù)反饋調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，這種抑制作用減弱會(huì)導(dǎo)致免疫功能亢進(jìn)，產(chǎn)生自身免疫病.FcγRIIB屬于低親和力受體，僅能與抗原抗體復(fù)合物或多聚IgG結(jié)合，相關(guān)研究表明豬的FcγRIIB能夠介導(dǎo)PRRSV的ADE作用［13］.目前，諸多研究致力于通過主動(dòng)干預(yù)FcγRIIB的異常表達(dá)，尋找治療自身免疫性疾病或腫瘤新的切入點(diǎn).

在豬的FcγRIIIA中發(fā)現(xiàn)存在胞外區(qū)只有1個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的選擇性剪切異構(gòu)體，且這種剪切異構(gòu)體不具備結(jié)合免疫復(fù)合物的功能，然而，這種剪切異構(gòu)體可以和包含另一結(jié)構(gòu)域的其他選擇性剪切異構(gòu)體互相作用，促進(jìn)Fc受體與免疫復(fù)合物的結(jié)合，并提高 FcγRIII受體產(chǎn)生的信號(hào)強(qiáng)度［15］.豬FcγRIIB雖尚未克隆出包含單個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域的選擇性剪切異構(gòu)體，但并不排除有這樣的可能性，將swFcγRIIB1 2個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分段表達(dá)并制備抗體，為進(jìn)一步研究2個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域在swFcγRIIB1結(jié)合免疫復(fù)合物的功能中發(fā)揮怎樣的作用，封閉一個(gè)Ig結(jié)構(gòu)域后與swFcγRIIB相互作用，是否促進(jìn)了FcγRII受體免疫復(fù)合物的攝取等方面打下基礎(chǔ).

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