河南省番茄潰瘍病的發(fā)現(xiàn)與分子確診

李江利，歐陽林杰，郭淼淼，蔣士君

(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，河南鄭州450002)

番茄細(xì)菌性潰瘍病(Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis，Cmm)是一種典型的種傳維管束病害，其病原為密執(zhí)安棒形桿菌密執(zhí)安亞種.該病首次發(fā)現(xiàn)于1909年的美國，1943年至1946年間曾在英國嚴(yán)重流行［1～3］，目前已普遍發(fā)生于歐美多國.因該病害危害嚴(yán)重且極易通過種苗和流水等傳播，中國等許多國家將其列為危險(xiǎn)性檢疫對(duì)象，但番茄潰瘍病在田間或溫室內(nèi)的再侵染危害要明顯輕于初侵染造成的損失［4～6］.中國番茄潰瘍病的記載始于1954年俞大紱和方中達(dá)在大連市場(chǎng)上采集到的“鳥眼斑”番茄果實(shí)［7］.但此病目前已分布于北京、河北、內(nèi)蒙古、遼寧、吉林、黑龍江、山西、山東和上海等多個(gè)省(市)的保護(hù)地和露地番茄田.一般田塊病株率在5% ～30%，重者高達(dá)70%以上，損失慘重［7］.作者于2009－03在鄭州市中牟縣白沙鄉(xiāng)部分溫棚番茄上發(fā)現(xiàn)了一批番茄潰瘍病疑似病株，調(diào)查發(fā)現(xiàn)該病由帶菌種苗傳播所致，在大棚內(nèi)適宜的溫濕度條件下病害迅速蔓延.由于番茄潰瘍病的高度危險(xiǎn)性和極易傳播性，帶菌種子或種苗會(huì)造成嚴(yán)重的病害并使作物減產(chǎn)，因此開發(fā)快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)技術(shù)對(duì)植物檢疫和病害的田間診斷都具有重要的意義［8］.半選擇性培養(yǎng)基、病害形態(tài)觀察及生化測(cè)定等常規(guī)的鑒定比較繁瑣，而PCR技術(shù)被認(rèn)為是非常有用的能快速鑒定病害的分子生物學(xué)技術(shù)［9，10］.為準(zhǔn)確鑒定此病害，并為迅速防治提供科學(xué)依據(jù)，作者在常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定的基礎(chǔ)上，重點(diǎn)探索了針對(duì)CMM的16-23S ITS和毒性基因的雙靶點(diǎn)PCR聯(lián)合鑒定技術(shù)，該技術(shù)對(duì)于快速、特異地檢測(cè)植物檢疫性番茄潰瘍病原細(xì)菌和病害的快速確診具有非常的意義.

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 發(fā)病組織樣品 采集鄭州市中牟縣白沙鄉(xiāng)的大棚內(nèi)發(fā)病番茄植株，采集的病株根、莖、葉及病株根圍土壤用來分離培養(yǎng)細(xì)菌.

1.1.2 主要試劑和試劑盒 TaqDNA聚合酶、pMD19-T載體試劑盒和PCR凝膠純化試劑盒均購自TaKaRa公司.

1.1.3 供試細(xì)菌菌株 番茄潰瘍病菌標(biāo)準(zhǔn)菌株T30(河南省農(nóng)科院惠贈(zèng))、大腸桿菌Jm109(河南農(nóng)業(yè)大學(xué)分子植物病理學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存).

1.2 方法

1.2.1 病原分離培養(yǎng) 對(duì)采集到的發(fā)病材料及病株根圍土壤使用NA培養(yǎng)基進(jìn)行常規(guī)分離和培養(yǎng)，置于27℃下培養(yǎng)2～3 d，根據(jù)菌落形態(tài)選擇代表性細(xì)菌分離物.

1.2.2 常規(guī)細(xì)菌學(xué)鑒定 菌體染色采用賴夫生染色法，革蘭氏反應(yīng)采用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%KOH水溶性法;氧化酶試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)及過敏性與致病性測(cè)定參照方中達(dá)［11］的方法.

1.2.3 分子生物學(xué)鑒定

1.2.3.1 基于 CMM 16-23S rDNA ITS 的 PCR 鑒定 根據(jù)已公開的CMM的ITS基因序列的保守性，設(shè)計(jì)了特異性引物5’-GCATGTGCACCTCTC CTCTGTAT-3’(ITS1)和 5’-TCACATGAGATTGAATCGTTTCGCCT-3’(ITS2).以具有誘導(dǎo)煙草過敏性能力的細(xì)菌分離物基因組DNA為模板進(jìn)行ITS PCR擴(kuò)增鑒定.預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為420 bp.反應(yīng)體系(25 μL)包括2.5 mmol·L－1dNTP 1 μL，5 U·mL－1Taq 聚合酶 0.5 μL，10 × PCR buffer 2.5 μL，引物 20 μmol·L－1各 1 μL，模板 1 μL.反應(yīng)條件:95℃ 5 min后;94℃ 1 min，55℃ 30 s，72℃ 1 min，25個(gè)循環(huán);72℃ 8 min.4℃保存PCR產(chǎn)物用質(zhì)量濃度為0.7%瓊脂糖電泳檢測(cè).擴(kuò)增后的ITS產(chǎn)物進(jìn)行T/A克隆，測(cè)序由上海捷瑞生物有限公司完成，采用DNAStar分析軟件對(duì)ITS基因序列比對(duì).

1.2.3.2 基于CMM 毒性基因的PCR鑒定 合成DREIER等［12］報(bào)道的CMM毒性基因擴(kuò)增引物5’-GCGAATAAGCCCATATCAA-3’(CMM5)/5’-CGTCAGGAGGTCGCCTAATA-3’(CMM6)，對(duì)有過敏性誘導(dǎo)能力的細(xì)菌分離物進(jìn)行PCR鑒定，預(yù)期擴(kuò)增產(chǎn)物為 614 bp.25 μL的反應(yīng)體系.反應(yīng)條件同1.2.3.1.

1.2.3.3 引物靈敏性測(cè)定 分別使用上述兩對(duì)引物進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，設(shè)6個(gè)模板菌落1×106～10 cfu，6個(gè)模板DNA梯度2 ng～20 fg，擴(kuò)增體系及反應(yīng)條件同上.8 μL PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.7%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄病害組織及根圍土壤分離結(jié)果

通過分離共得到20個(gè)分離物，其中8個(gè)來自于莖稈，6個(gè)來自于葉片，4個(gè)來自于果實(shí)，2個(gè)來自于根圍土壤.

2.2 病害分離物過敏性、致病性測(cè)定結(jié)果

20個(gè)分離物過敏性測(cè)定結(jié)果為有12個(gè)分離物有過敏性反應(yīng)，將這12個(gè)分離物進(jìn)行致病性測(cè)定(蘸根法)，J03，J07，J16，Y02，Y03，Y07，G01，G02和R01共9個(gè)分離物表現(xiàn)出葉片萎焉癥狀，將9個(gè)分離物接種至番茄幼果上(針刺法)，3～4 d后出現(xiàn)典型的“鳥眼斑”癥狀.而分離物Y05，G04與J08未表現(xiàn)出葉片萎焉及“鳥眼斑”癥狀.

2.3 生理生化測(cè)定結(jié)果

通過對(duì)12株有過敏性反應(yīng)的分離物進(jìn)行方法中列舉的3項(xiàng)生理生化測(cè)定知上述有致病性反應(yīng)的9個(gè)分離物形態(tài)與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致，即為革蘭氏陽性菌，氧化酶試驗(yàn)反應(yīng)陰性，明膠液化能力較弱.

2.4 形態(tài)學(xué)鑒定

對(duì)分離物的菌落形態(tài)觀察知上述9個(gè)分離物菌落呈圓形，表面有突起，邊緣整齊，不透明，粘稠，顏色初為淡黃色，后變成明顯的黃色，經(jīng)菌體染色知這些分離物菌體分裂時(shí)呈“V”字形，這是番茄潰瘍病菌分裂時(shí)特有的現(xiàn)象，與標(biāo)準(zhǔn)菌株一致，因此可以初步確定分離出的9個(gè)分離物為同一種致病菌，均為番茄潰瘍病菌.

2.5 致病性分離物的雙基因聯(lián)合鑒定

根據(jù)番茄潰瘍病菌保守序列設(shè)計(jì)引物的ITS1/ITS2及DREIER等［12］設(shè)計(jì)的擴(kuò)增毒性基因的引物CMM5/CMM6，對(duì)有過敏性反應(yīng)的12個(gè)菌株進(jìn)行擴(kuò)增，上述9個(gè)菌株均能擴(kuò)增出420 bp與614 bp的目標(biāo)片段，其余3個(gè)菌株則均無條帶產(chǎn)生(圖1).

圖1 番茄潰瘍病菌的ITS及毒性基因PCR檢測(cè).ITS1/ITS2(A)及CMM5/CMM6(B)Fig.1 ITS and toxic gene PCR analysis of Clavibacter michiganensis subsp.michiganensis

2.6 靈敏度檢測(cè)結(jié)果

利用不同含量的CMM(1×106～10 cfu)模板菌落和模板DNA(2 ng～20 fg)，對(duì)2對(duì)引物進(jìn)行靈敏度檢測(cè)，模板菌落最低均可檢測(cè)到1×103cfu·mL－1.引物對(duì) ITS1/ITS2最低可檢測(cè)到2 pg模板DNA的目標(biāo)菌，但引物對(duì)CMM5/CMM6靈敏性略低于引物對(duì) ITS1/ITS2，只可檢測(cè)到20 pg模板DNA的目標(biāo)菌(圖2).

圖2 引物對(duì)靈敏性檢測(cè)結(jié)果Fig.2 Determination of the sensitivity ITS1/ITS2(A)及CMM5/CMM6(B)

2.7 基于ITS序列的系統(tǒng)進(jìn)化分析

ITS序列在進(jìn)化過程中可以將突變保留下來，從而多態(tài)性更高，一般可以將微生物區(qū)分到亞種，因此對(duì)致病菌進(jìn)行ITS序列系統(tǒng)進(jìn)化分析.通過雙基因鑒定知9種分離物為頻繁出現(xiàn)的同一個(gè)致病菌株，因此對(duì)菌株J16的ITS序列PCR擴(kuò)增后進(jìn)行T/A克隆，測(cè)序后分析J16與GeneBank上已登錄的11個(gè)同源物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系(圖3)，得知J16菌株屬于CMM亞種，而與同種的其它4個(gè)亞種親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，但與同一個(gè)亞種內(nèi)的已知菌株又有所區(qū)別.

圖3 CMM菌株J16(ZM09J16ITS.seq)ITS序列及其11個(gè)同源物的系統(tǒng)進(jìn)化關(guān)系圖Fig.3 Phylogenetic tree of ITS gene of CMM and the homologens

3 結(jié)論與討論

本試驗(yàn)經(jīng)分離純化共得到20個(gè)分離物，通過過敏性、致病性測(cè)定及基本的細(xì)菌學(xué)特性鑒定，得知有9個(gè)菌株理化性質(zhì)及菌體形態(tài)與已報(bào)道的番茄潰瘍病菌一致:有過敏性與致病性反應(yīng);革蘭氏陽性;菌落形態(tài)米黃色、圓形凸起、邊緣光滑、菌落粘稠、不透明;菌體分裂時(shí)呈“V”字形特征，由此初步確定此9個(gè)菌株為同一種病原菌，即為番茄潰瘍病菌.

在此基礎(chǔ)上進(jìn)行分子生物學(xué)鑒定，根據(jù)番茄潰瘍病菌的ITS序列設(shè)計(jì)引物及使用DREIER等［12］設(shè)計(jì)的擴(kuò)增毒性基因的引物對(duì)有過敏性反應(yīng)的菌株進(jìn)行PCR擴(kuò)增，9個(gè)分離物均擴(kuò)增出與預(yù)期一致的420 bp與614 bp的產(chǎn)物，取菌株J16擴(kuò)增出的ITS測(cè)序后與公開的CMM菌株的ITS序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析，結(jié)果表明此菌株屬于CMM亞種，而與CMN，CMS，CMT和 CMI等亞種的親緣關(guān)系較遠(yuǎn).因此，通過ITS及毒性基因的聯(lián)合鑒定最終鑒明該致病菌確為番茄潰瘍病菌.對(duì)兩對(duì)引物進(jìn)行靈敏性測(cè)定，模板菌落最低均可檢測(cè)到1×103cfu·mL－1.引物對(duì) ITS1/ITS2最低可檢測(cè)到2 pg模板DNA的目標(biāo)菌，但引物對(duì)CMM5/CMM6靈敏性略低于引物對(duì) ITS1/ITS2，只可檢測(cè)到20 pg模板DNA的目標(biāo)菌.

PCR技術(shù)以其快速簡(jiǎn)便、靈敏度高、特異性強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，成為研究的熱點(diǎn)，在各領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用和迅速發(fā)展，尤其對(duì)病害病原的鑒定是非常有用的，是現(xiàn)代病原鑒定常用的方法.DREIER等［12］利用番茄潰瘍病菌攜帶的質(zhì)粒為靶序列進(jìn)行檢測(cè)，但由于該質(zhì)粒易突變，多態(tài)性強(qiáng)，不同菌株之間變異大，不能將所有菌株都鑒定出來.本實(shí)驗(yàn)對(duì)菌株J16進(jìn)行質(zhì)粒抽提后，檢測(cè)得知并未提出毒性質(zhì)粒，但是提取基因組后可以通過PCR檢測(cè)到毒性基因，因此認(rèn)為該質(zhì)?？赡苷线M(jìn)基因組中.16S和23S間的ITS序列在不同屬種中的拷貝數(shù)以及堿基序列都有不同，多態(tài)性更高，一般可以將微生物區(qū)分到亞種，因而是進(jìn)行細(xì)菌種下分類鑒定的理想?yún)^(qū)域［13］.基于ITS基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物ITS1/ITS2最低靈敏度可檢測(cè)到1×103cfu模板菌落和2 pg模板DNA的目標(biāo)菌，靈敏度高于付鵬等報(bào)道的最低可檢測(cè)到1×105cfu菌體和50 pg模板DNA的目標(biāo)菌的引物［14］.本試驗(yàn)使用番茄潰瘍病菌的毒性基因及ITS序列的聯(lián)合鑒定具有準(zhǔn)確快速性，避免了毒性基因鑒定不能將所有菌株都鑒定出的缺陷，并通過ITS序列測(cè)定確定了病害所屬的種，目前發(fā)現(xiàn)還未有此鑒定方法.

本試驗(yàn)經(jīng)過一系列測(cè)定確定了番茄細(xì)菌性潰瘍病的發(fā)生，該檢疫性病害在河南的鑒定在以往文獻(xiàn)中尚無報(bào)道，因此，這是河南省首次發(fā)現(xiàn)并確診番茄細(xì)菌性潰瘍病.研究結(jié)果將為病害的分子檢測(cè)和潰瘍病的防治提供重要依據(jù)，建議今后在生產(chǎn)中應(yīng)加強(qiáng)番茄種苗的檢疫檢驗(yàn)，防止該病害的擴(kuò)散蔓延.

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