電針配合益髓湯對鋁中毒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型兔腦脊液中谷氨酸的影響*

王孟琳 王瑞輝 王婧錦 張 紅 徐 倩 吳世衛(wèi) 陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽 712046)

運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病是是一組選擇性侵犯運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的慢性進(jìn)行性變性疾病。它的主要病理改變是選擇性地?fù)p傷運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元(包括大腦皮質(zhì)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元、腦干運(yùn)動(dòng)神經(jīng)核和脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元等)。起病隱襲,持續(xù)進(jìn)展,致殘率與死亡率極高。目前為止,本病的病因及發(fā)病機(jī)制仍不清楚,亦無有效治療手段。既往研究提示,中醫(yī)藥多樣化的綜合治療手段可能為本病帶來希望。臨床實(shí)踐證明:中醫(yī)藥治療本病療效較為滿意,安全無毒、副作用小,但對其實(shí)驗(yàn)報(bào)道還是較少。為了更深入地探討中醫(yī)藥治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的有效性和作用機(jī)理,我們采用比色法測定鋁中毒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型兔腦脊液中谷氨酸(Glu)水平,研究電針配合益髓湯對鋁中毒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型兔腦脊液中興奮性谷氨酸的影響作用,探討中醫(yī)藥治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的療效與機(jī)理,為臨床推廣應(yīng)用,提供可靠的依據(jù)。現(xiàn)將實(shí)驗(yàn)結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法 1.1動(dòng)物與藥物購置成年健康日本大耳白兔 50只(體重 2.5±0.5kg),雌雄各半;由第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,批號為 SCKX(陜)2008-008。適應(yīng)性飼養(yǎng) 3d后,隨機(jī)分成 5組:空白對照組、模型對照組、電針治療組、中藥治療組和電針配合益髓湯治療組,每組 10只。中藥益髓湯組成中的黨參、白術(shù)、黃芪、炙草、熟地黃、補(bǔ)骨脂、菟絲子、牛膝、川斷、枸杞、當(dāng)歸、白芍、雞血藤、龜甲、鹿角霜等藥物均購自陜西中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院中藥房,組方配制煎熬后,裝袋冷藏備用;谷氨酸比色試劑盒、723可見分光儀等均購自武漢博士德生物技術(shù)工程公司,方法按說明書操作。

1.2 制作病理模型參考改良的曾氏法造模。模型對照組、電針治療組、中藥治療組和電針配合中藥治療組 4組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均采用鋁中毒復(fù)制模型;即在大白兔的項(xiàng)背部每日注射 2.5%氯化鋁溶液 1mL/kg,1次 /d,連續(xù) 25d;制作成鋁中毒所致的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病理模型?？瞻讓φ战M則注射等量 0.9%生理鹽水,1次 /d,共 25d。經(jīng)觀察用藥后大白兔行為動(dòng)作及肢體表現(xiàn),如出現(xiàn)行走困難、肢體震顫、口角流涎等現(xiàn)象 ,視為造模成功。

1.3 治療方法 造模成功后開始治療,空白對照組大白兔每日定時(shí)抓拿 1次,不作任何治療。模型對照組可每日注射適量生理鹽水;針刺治療組大白兔進(jìn)行穴位電針治療,取穴根據(jù)《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》與《中國獸醫(yī)針灸學(xué)》結(jié)合定位。電針選用疏密波,頻率在 18-20Hz,電壓為 1.5V;取穴主要有足三里、髀關(guān)、伏兔、解溪、肩、曲池、合谷、懸鐘、陽陵泉、脾俞、肝俞、腎俞、大椎。各穴可交替選用,連續(xù)治療 5d,停 2d,在作下 1療程,連續(xù) 5個(gè)療程。中藥治療組采用益髓湯灌胃治療,每日 2次,分早晚各1次。連用 5d,停 2d,在作下 1療程 ,連續(xù) 5個(gè)療程。針?biāo)幣浜现委熃M采用電針聯(lián)合服用中藥益髓湯,針?biāo)幉⒂?,綜合治療,連續(xù)5個(gè)療程。

1.4 標(biāo)本取材 分別于第 5療程結(jié)束后,將 5組受試兔按 3.5mL/kg標(biāo)準(zhǔn)腹腔注射 10%水合氯醛進(jìn)行麻醉,然后采取腦脊液。即先將受試兔頭頸交接處毛發(fā)剔除,暴露皮膚,以手指按壓尋找其枕骨粗隆,在該粗隆下確定受試兔顱后窩凹陷的位置。先以碘伏和 75%醫(yī)用酒精消毒此處,將準(zhǔn)備好的 5mL注射器從此處緩緩直刺入皮下,當(dāng)針下有落空感時(shí),再向兔頭方斜刺5mm左右,使針尖進(jìn)入受試兔枕大池。此時(shí)輕輕抽吸注射器,可見淡黃色、清亮、透明的腦脊液緩緩被吸出,若注射器抽吸困難,則對刺入的角度和深度作微小調(diào)整,切不可深刺,以免損傷受試兔的延髓組織。每只采集新鮮腦脊液 0.5～ 1mL,立即置于液氮中凍存?zhèn)錂z。

1.5 樣本測定腦脊液中谷氨酸含量的測定按谷氨酸比色法試劑盒說明書操作。即先處理采集的每份標(biāo)本,然后用 723可見分光光度計(jì)測得各管吸光度 A1、A2值 ,再計(jì)算出其谷氨酸濃度;主要操作步驟:①前處理:取 0.2mL腦脊液加 0.6mL試劑一充分混勻,3000～ 3500轉(zhuǎn) /min,離心 10min,取上清 0.5mL待測。②將試劑二、三、四和蒸餾水分別按 1.0×(n+ 4)、0.1× (n+4)、 0.01× (n+4)、 0.39× (n+4)的比 例配制好混合試劑(n:樣本數(shù))。③分別在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管中加入 1.5mL混合試劑,再在空白管、標(biāo)準(zhǔn)管和測定管中分別加入蒸餾水、200 μmol/L谷氨酸標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)用液、待測上清液各 0.5mL?；靹?340nm處,1cm,光徑,蒸餾水調(diào)零,測各管吸光度 A1值。然后各管均加入試劑五 0.02mL。混勻,37℃水浴 40min,取出后于 340nm處,1cm,光徑,蒸餾水調(diào)零,測各管吸光度 A2值。④按照計(jì)算公式算出谷氨酸含量值。即:谷氨酸濃度(μmol/L)=(測定管 A2值-測定管 A1值)-(空白管 A2值-空白管 A1值 )(標(biāo)準(zhǔn)管 A2值-標(biāo)準(zhǔn)管 A1值)-(空白管 A2值-空白管 A1值 )=標(biāo)準(zhǔn)濃度 (200μmol/L)×樣本測試前稀釋倍數(shù)(4)。

1.6 統(tǒng)計(jì)處理各觀測指標(biāo)均采用 SPSS統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析處理。腦脊液含量測定結(jié)果以±s表示,各組間比較采用 t檢驗(yàn) ,P＜ 0.05為統(tǒng)計(jì)學(xué)上差別有顯著性。

2 結(jié)果與結(jié)論 2.1結(jié)果 各組大白兔檢測的腦脊液中谷氨酸含量(單位:μmol/L)結(jié)果如下表所示:

附表 各組動(dòng)物腦脊液谷氨酸含量檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±s,μ mol/L)

附表 各組動(dòng)物腦脊液谷氨酸含量檢測統(tǒng)計(jì)結(jié)果(±s,μ mol/L)

注:與空白組比較,△表示 P＜0.05;與模型組比較,▲P＜0.01.

組 別 n 谷氨酸含量空白對照組 9 35.54± 8.51模型對照組 8 55.83±21.48△中藥治療組 9 38.75± 6.94▲電針治療組 8 37.86± 9.71▲針?biāo)幣浜辖M 8 36.97± 6.57▲

附表可見:模型對照組與空白組對照比較,腦脊液谷氨酸含量表達(dá)明顯升高(P＜0.05);治療后,電針治療組、中藥治療組和針?biāo)幣浜现委熃M腦脊液谷氨酸含量均較模型對照組明顯降低(P＜0.05);電針治療組、中藥治療組、針?biāo)幣浜辖M組間比較無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 結(jié)論檢測結(jié)果顯示:模型對照組腦脊液中谷氨酸含量明顯升高,而電針治療組、中藥治療組和針?biāo)幣浜现委熃M腦脊液中谷氨酸含量明顯低于模型對照組,尤其是針?biāo)幣浜现委熃M腦脊液中谷氨酸含量在 3個(gè)治療組中最低,趨近于空白對照組。說明電針和益髓湯對鋁中毒運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型兔腦脊液中谷氨酸有抑制作用,也證實(shí)了電針和益髓湯治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的有效性,可有效的阻止興奮性氨基酸的毒性作用。

3 討 論 祖國醫(yī)學(xué)認(rèn)為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病屬于“痿癥”范疇,中醫(yī)藥治療具有明顯的臨床效果。本實(shí)驗(yàn)研究也有力的證明了中醫(yī)治療運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病的有效性。通過實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可以看出:電針和益髓湯可降低運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型兔腦脊液中谷氨酸的含量,有效的阻止興奮性氨基酸的毒性作用,緩解了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的中毒表現(xiàn)。谷氨酸(Glu)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)重要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì),谷氨酸能神經(jīng)元過度激活及突觸間隙中的谷氨酸過多堆積均可通過激活谷氨酸受體對突觸后神經(jīng)元及其組織造成興奮毒性。谷氨酸興奮性中毒引起中樞神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的作用機(jī)制可能與以下因素有關(guān):①突觸前膜對興奮性氨基酸過度釋放或攝取異常,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)源性興奮性氨基酸增多;②運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性氨基酸受體數(shù)量、組成的異常。中樞神經(jīng)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的選擇性損傷可能說明運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元 Ca-AMPA KA受體的數(shù)量、組成與其他未受累的神經(jīng)元不同。③鈣離子內(nèi)流與選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷有關(guān)。目前研究證實(shí)無 GluR2表達(dá)的 AM PA受體可允許鈣離子流入細(xì)胞內(nèi),而 GluR2在人類的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元低水平表達(dá)。另一方面,運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元缺乏鈣離子結(jié)合蛋白的表達(dá),必須依靠線粒體攝取鈣離子緩沖細(xì)胞內(nèi)鈣離子負(fù)荷。故 GluR2可能是 Ca-AM PA KA受體介導(dǎo)選擇性運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元損傷的中心。④谷氨酸引起神經(jīng)元 NO合成酶(nNOS)的激活產(chǎn)生過多的 NO和過氧亞硝基(ONOO),對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元造成損傷。總之 ,谷氨酸能產(chǎn)生特殊的神經(jīng)毒性作用并誘發(fā)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元變性。高水平的谷氨酸聚集在神經(jīng)突觸間隙,過度刺激突解后膜細(xì)胞,導(dǎo)致過度去極化。而細(xì)胞間鈣離子水平的持續(xù)增高,引起鈣離子介導(dǎo)的細(xì)胞外分泌。細(xì)胞鈣離子通道激活后,水解酶增多,產(chǎn)生自由基,細(xì)胞滲透腫脹,從而引起細(xì)胞溶解。細(xì)胞內(nèi)的谷氨酸釋放到細(xì)胞外液,作用于鄰近的神經(jīng)元引起進(jìn)一步的興奮,形成谷氨酸放大回路?？梢?細(xì)胞外的谷氨酸、去極化和細(xì)胞溶解相互影響延續(xù)和加重了神經(jīng)變性的過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示我們,電針和益髓湯能降低運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元病模型兔腦脊液中谷氨酸的含量,可能的作用途徑:一是電針和益髓湯阻抑了神經(jīng)元突觸前膜對興奮性氨基酸過度釋放或攝取異常,導(dǎo)致運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元突觸間隙內(nèi)源性興奮性氨基酸減少;二是限制了鈣離子的內(nèi)流,提高了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元與鈣離子結(jié)合蛋白結(jié)合的能力;降低了運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元興奮性氨基酸受體的數(shù)量;三是抑制了 NO合成酶的活性,提高了體內(nèi)的自由基清除劑的能力,清除了對運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元有損害作用的自由基;從而降低了腦脊液中谷氨酸的含量,減少了興奮性氨基酸的毒性。但對其具體的作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究探討。

[1] 曾常春.肌萎縮側(cè)索硬化癥的動(dòng)物模型研究進(jìn)展[J].中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志 ,2004,19(6):479-480.

[2] 王松鶴,李俐.興奮性氨基酸神經(jīng)毒性及作用機(jī)制研究進(jìn)展 [J].現(xiàn)代實(shí)用醫(yī)學(xué) ,2009,(8):224-6.

[3] 任振宇 ,于小倩,彭雙清.興奮性神經(jīng)毒性中的鈣穩(wěn)態(tài)失調(diào)及其在退行性病變中的作用 [J].中國藥理學(xué)通報(bào),2007,23(3):289-292.

[4] 鄒建成,羅良鳴.興奮性氨基酸的神經(jīng)毒性研究進(jìn)展[J].中華醫(yī)學(xué)實(shí)踐雜志 ,2005,4(8):775-777.

[5] 李淑蘭,劉鳳蓮,王學(xué)斌,等.谷氨酸及其受體在腦內(nèi)的存在作用與谷氨酸的神經(jīng)毒性 [J].中國臨床康復(fù),2004,(22):27-29.

[6] 岳少杰.谷氨酸的興奮性神經(jīng)毒性作用與中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷 [J].國外醫(yī)學(xué)?神經(jīng)病學(xué)神經(jīng)外科學(xué)分冊,1994,(4):50-52.