前列舒通膠囊治療慢性前列腺炎模型大鼠脊髓背角中降鈣素基因相關(guān)肽表達(dá)的改變*

陳瑾歆 李云祥 王安果 張宗平 川北醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室(南充 637000)

慢性前列腺炎(Chronic prostatitis,CP)疼痛是其最主要的癥狀,因?qū)ζ渫匆蛑两裆袩o滿意的解釋,治療相當(dāng)棘手 ,嚴(yán)重影響著患者的生活質(zhì)量。西醫(yī)改善疼痛癥狀效果不明顯,中成藥常有較好的療效,前列舒通膠囊(保定步長(zhǎng)天浩制藥有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字 Z20027140)能較好改善 CP的臨床癥狀 ,中藥治療 CP分子機(jī)制尚不明確,本文采用不同劑量前列舒通治療慢性前列腺炎癥大鼠,檢測(cè)模型大鼠脊髓背角中 CGRP的表達(dá)的表達(dá),探討前列舒通治療慢性前列腺炎的分子機(jī)制。

1 材料和方法 1.1主要試劑和儀器 RN A抽提純化試劑盒 ,TaKaRa Ex Taq HS酶,RT試劑盒 ,DNaseⅠ (大連寶生物生物技術(shù)有限公司),實(shí)時(shí)定量檢測(cè)擴(kuò)增儀 (Bio-RAD,USA)。

1.2 動(dòng)物模型的分組和制備 3月齡雄性 SD大鼠 40只,完全隨機(jī)選取 8只為正常對(duì)照組 ,其余 32只為實(shí)驗(yàn)組,實(shí)驗(yàn)組在大鼠前列腺側(cè)葉注射完全弗氏佐劑 20μL制備慢性前列腺炎動(dòng)物模型,正常對(duì)照組注射等量生理鹽水,術(shù)后 20d實(shí)驗(yàn)組大鼠完全隨機(jī)分為炎癥組、前列舒通治療高、中、低劑量組(n=8),每組大鼠經(jīng)灌胃給藥,前列舒通高、中、低劑量組給藥劑量為 0.84g/kg、0.42g/kg、0.21g/kg,1次 /d。正常對(duì)照組、炎癥組給予相應(yīng)體積蒸餾水。

給藥第 30天于末次給藥 24h后處死,縱行剖開椎管顯露脊髓,在解剖顯微鏡下取出 L5-S2脊髓背角組織備用。同時(shí)取前列腺組織作 HE染色觀察組織的水腫、血管密度、白細(xì)胞數(shù)量和作甲苯胺藍(lán)染色觀察組織的肥大細(xì)胞密度鑒定前列腺炎癥。

1.3 cDN A第一鏈的合成 將 1.2取出的脊髓背角組織抽提總 RNA,加入 DNaseⅠ處理總 RNA去除基因組 DNA,取約1.5 μg總 RNA為模板合成 cDNA,-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物和探針的設(shè)計(jì) 根據(jù) Genbank中大鼠 CGRP和GAPDH基因序列用 Primer Express 3.0軟件設(shè)計(jì)適用于 FQRT-PCR反應(yīng)的特異引物和探針,由大連寶生物生物技術(shù)有限公司合成。CGRP-F:5'-GTTGTCAGCATCTTGCTCCTGTA C-3'CGRP-R:5'-CAGCCAGTAGGCGAGCT TCTT-3'CGRPP:5'-fam-CGGCCTCCAGGCAGTCCCT TTG-tamra-3'。GA PDH-F:5'-GCAAGGAT ACTGAGCAAGAGAGA-3'GAPDH-R: 5'-CCAGGCCCCTCCTGTTGT-3'GAPDH-P: 5'-fam-AGTCCCCATCCCAACTCAGCCCC-tamra-3'。

1.5 實(shí)時(shí)熒光 PCR(FQ-PCR)在實(shí)時(shí)檢測(cè)擴(kuò)增儀(Bio-RAD,USA)上擴(kuò)增并檢測(cè)熒光,每個(gè)樣本重復(fù) 3次,反應(yīng)體系25μL:10× PCR buffer2.5μL,2.5mM dNT P mixture2μL,25mMMgcl2 4μL,5U/μL TaKaRa Taq 酶 0.5μL,20pmol/μL熒光探針 0.3 μL,CGRP的特異上下游引物(10pmol/μl)各1μL,cDN A摸板 2μL,去離子水補(bǔ)足 25μL。內(nèi)參照 GAPDH的反應(yīng)體系同。反應(yīng)條件:95℃ 變性 5min;以 94℃ 30S,60℃1 min同時(shí)檢測(cè)熒光進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)。以每個(gè)樣品 CGRP和GAPDHCt值的比值作為 CGRP的表達(dá)水平,比值越小,CGRP的表達(dá)水平越高。

2 結(jié) 果 不同組別模型大鼠 CGRP在脊髓背角中的表達(dá) CGRP和 GAPDH RT-PCR熒光擴(kuò)增曲線均呈典型的“S”型,CGRP mRNA的表達(dá)見表 1,結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組大鼠脊髓背角中 CGRP mRNA表達(dá)顯著增高(P＜0.01)。

附表 模型大鼠脊髓背角中 CGRP mRNA表達(dá)(CGRP/GAPDH,±s,n=8)

附表 模型大鼠脊髓背角中 CGRP mRNA表達(dá)(CGRP/GAPDH,±s,n=8)

▲與對(duì)照組比較 P＜0.05,△與炎癥組比較 P＜0.05◇與低劑量組比較 P＜0.05

Group 正常對(duì)照組 炎癥組 高劑量組 中劑量組 低劑量組CGRP/GAPDH 1.198± 0.021 1.133± 0.008▲ 1.157± 0.008▲△◇ 1.152± 0.010▲△◇ 1.140± 0.008▲

3 討 論 L5-S2脊髓背角是前列腺組織感覺信息的初級(jí)傳入中樞,在前列腺炎性信息的傳遞和整合過程中有著重要作用[1]。近年來的研究表明,炎癥刺激可使脊髓背角表達(dá)、釋放CGRP增多[2],脊髓背角中 CGRP的釋放及其受體的激活是傷害性感受信息傳遞和調(diào)控過程中一個(gè)重要的環(huán)節(jié)[3]。 CGRP是目前公認(rèn)與疼痛等傷害性信息傳導(dǎo)密切相關(guān)的神經(jīng)遞質(zhì),參與痛覺信息傳遞及痛覺過敏的形成[4]。Pontari M A等[5]認(rèn)為神經(jīng)生長(zhǎng)因子 (nerve growth factor,NGF)在 CP疼痛產(chǎn)生、發(fā)展中起重要作用,我們以前的實(shí)驗(yàn)研究也證實(shí),CP大鼠前列腺組織中 NGF表達(dá)增加。而炎癥時(shí)局部 N GF含量的升高可以上調(diào)脊髓背角中 CGRP的表達(dá)[6],在病理性疼痛特別是慢性疼痛的發(fā)生機(jī)制中起重要作用。因此,我們推測(cè) CGRP可能直接或與NGF協(xié)同參與了 CP疼痛的發(fā)生和維持。

前列舒通膠囊主要成分是黃柏、赤芍、土茯苓、馬鞭草、虎耳草、馬齒莧、川芎、川牛膝、柴胡、當(dāng)歸、澤瀉、甘草等?？汕鍩崂麧?化瘀散結(jié),治療慢性前列腺炎有明顯的臨床療效,但為中醫(yī)辨證經(jīng)驗(yàn)治療,分子機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)不同劑量前列舒通治療慢性前列腺炎癥大鼠大鼠脊髓背角中 CGRP的表達(dá),結(jié)果顯示慢性前列腺炎炎癥組、前列舒通治療高、中、低劑量組大鼠前列腺組織中 CGRP的表達(dá)比正常對(duì)照組明顯增高;前列舒通膠囊治療的各組大鼠CGRP的表達(dá)均較炎癥組降低,其中高、中劑量組降低更明顯,低劑量組與炎癥組無明顯差異,高劑量組和中劑量組 CGRP的表達(dá)無明顯差異,這提示 CGRP的高表達(dá)在慢性前列腺炎發(fā)病發(fā)展中可能有重要作用。前列舒通可能通過降低 CGRP的表達(dá)改善、治療慢性前列腺炎。

4 結(jié) 論 CGRP mRNA在慢性前列腺炎疼痛模型大鼠脊髓背角中的表達(dá)明顯增高,在慢性前列腺炎疼痛和持續(xù)狀態(tài)中可能有重要作用,前列舒通膠囊可降低炎癥大鼠 CGRP的表達(dá),改善其臨床癥狀。

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