星形孢菌素生物合成途徑的研究進展

趙雪爾，劉駿，陳敏

星形孢菌素（Staurosporine，STA）是從 Streptomyces Staurosporeus AM-2282 分離得到的一種生物堿。X 射線晶體結(jié)構分析發(fā)現(xiàn)它由一個吲哚咔唑核心和通過雙 C-N 鍵連接的氨基己糖構成[1]。1986 年，人們發(fā)現(xiàn)它是一種對蛋白激酶 C（protein kinase C，PKC）非常有效的拮抗劑，因此該化合物被廣泛用于各類細胞 PKC 在信號傳導過程中所起作用的研究。STA 是目前已知的最有效的蛋白激酶抑制劑之一（IC50= 1 ～ 20 nmol/L）[2]，由于其結(jié)構合成的復雜性和重要的生理活性，引起了眾多有機合成化學家的興趣。1995 年，Link 等[3]對它的合成全過程進行了描述。許多生物學家也對星形孢菌素的生物合成功能途徑及改造進行了相關研究。本文將對星形孢菌素的來源，生物途徑及改造工作進行綜述。

1 星形孢菌素的生物合成基因簇

由于星形孢菌素的重要作用，人們對其生物合成途徑展開研究。通過同位素標記 STA 產(chǎn)生菌內(nèi)的前體化合物[4]，發(fā)現(xiàn)吲哚咔唑核心來源于色氨酸，糖殘基來源于葡萄糖，氨基糖連接后修飾的 O- 和 N-甲基的碳原子和質(zhì)子直接來源于蛋氨酸[5]。

研究表明，STA 的生物合成基因簇由 15 個開放閱讀框（open reading frame，ORF）組成，總長 22 kb[6-7]，基因結(jié)構如圖 1 所示。

圖 1 星形孢菌素基因簇結(jié)構

星形孢菌素的生物合成路徑如圖 2 所示。中間產(chǎn)物CPA（chromopyrrolic acid）的形成需要 StaO 和 StaP 的催化。在 StaO 作用下，L-色氨酸氧化脫氨基啟動合成反應發(fā)生，形成吲哚-3-丙酮酸（IPA）的亞胺形式。亞鐵血紅素蛋白四聚體 StaD 在 NH4+存在的條件下，催化兩分子的 IPA產(chǎn)生 CPA[8]。StaD 家族的蛋白質(zhì)由將近 1000 個氨基酸組成，氨基酸序列推導時發(fā)現(xiàn)它們沒有明顯保守區(qū)，這表明StaD 家族是血紅素蛋白中新的一類，具有不同的結(jié)構和功能[9]。開放式的 CPA 必須轉(zhuǎn)化成封閉式的吲哚咔唑糖苷配基，這就需要一對酶——StaP/StaC 催化形成吲哚咔唑核心[10-12]，即 K252c。隨后通過糖基化形成 STA。糖基化在STA 合成中十分重要，因為吲哚咔唑發(fā)揮生物活性需要糖基參與。糖殘基通過糖基轉(zhuǎn)移酶 StaG 連接氨基糖的 C-1’和 K252c 的 N-13，產(chǎn)生新的吲哚生物堿 holyrine A，StaN P450 連接 C-5’ 和 N-12 建立第二個 C-N 鍵，產(chǎn)生 O-去甲基-N-去甲基 STA，隨后 StaMA 和 StaMB 甲基轉(zhuǎn)移酶連續(xù)作用于這個中間產(chǎn)物，最終形成 STA[13]。各基因在STA 基因簇中的作用如表 1。

圖 2 星形孢菌素的生物合成路徑

表 1 合成星形孢菌素的基因及其功能

星形孢菌素生物合成的一個關鍵步驟是在細胞色素P450 StaP 的催化下通過分子內(nèi) C-C 鍵的形成和 CPA 的氧化脫羧形成吲哚咔唑核心。

StaP 屬于細胞色素 P450 酶家族（P450s）。P450s 廣泛分布于植物、哺乳動物、昆蟲和細菌中，催化類固醇激素的合成、藥物代謝和許多其他重要的單加氧反應。近年來P450 StaP 引起了許多研究者的興趣，不僅因為 STA 重要的抗腫瘤活性，更是由于 P450 StaP 在 STA 合成中特別的催化作用：芳基-芳基的連接和氧化脫羧，而不是常見的氧插入。StaP 反應體系包括鐵氧還蛋白（ferredoxin）、黃素氧還蛋白 NADP+還原酶（flavodoxin NADP+-reductase）、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（磷酸）[NAD(P)H]和氧分子，在其催化下 CPA 形成三種不同氧化水平的吲哚咔唑化合物：K252c，arcyriaflavin A和 7-羥基-K252c。值得注意的是，在額外加入 StaC 時只形成一種產(chǎn)物：K252c（STA 的糖苷配基）[14]。Howard-Jones 和 Walsh[15]經(jīng)過對芳基-芳基連接后非酶催化步驟的研究認為 StaC 對中間產(chǎn)物起攔截和重定向作用，從而只產(chǎn)生了 K252c。18O 同位素標記的實驗表明 K252c 吡咯酮上的氧原子來自于氧氣，兩分子的氧氣產(chǎn)生一分子的 K252c[14]。

通過對 StaP 晶體學的研究，得到了 CPA 結(jié)合和非結(jié)合時 StaP X 衍射晶體結(jié)構圖[5]。從圖中觀察到，StaP 具有P450 的保守結(jié)構即十二個 α 螺旋（A ～ L）及其所特有的兩個 β 折疊。StaP 不與底物結(jié)合時呈現(xiàn)一種開放的構型，暴露其活性位點，使 CPA 易于接近亞鐵血紅素周圍的底物結(jié)合區(qū)。當 CPA 靠近時，底物結(jié)合區(qū)的部分氨基酸殘基重新定位與 CPA 相互作用，同時疏水性殘基 Trp-97、Phe-100和 Phe-403 也改變位置，優(yōu)化底物和酶的相互作用。CPA接近 StaP 的過程中，兩個羧基的氫鍵作用和吲哚環(huán)的T 型 π - π 鍵作用使底物進入 StaP 的底物結(jié)合腔。CPA 在StaP 的活性位點呈現(xiàn)一種扭曲的蝴蝶型，幾乎垂直于亞鐵血紅素平面。

整體上看，CPA 是在 P450 StaP 的催化下失去兩個質(zhì)子形成環(huán)閉結(jié)構。根據(jù)這一現(xiàn)象，許多研究者對其反應機理提出了假說。Howard-Jones 和 Walsh[15]認為 StaP 催化C-C 形成起始于 CPA 兩個吲哚環(huán) C-H 上質(zhì)子的轉(zhuǎn)移，再通過一系列的非酶催化反應形成最終產(chǎn)物。通過分析CPA-StaP 復合物 X 衍射晶體結(jié)構圖可知[5]，CPA 中靠近亞鐵血紅素的吲哚基團周圍的靜電勢與細胞色素 C 過氧化物酶（cytochrome c peroxidase，CcP）周圍的類似，故推測，在 Cpd I（StaP）-CPA 中涉及了一個單電子還原的 Cpd II 和一個單電子氧化的 CPA（Cpd I 和 Cpd II 在CcP 中稱為 CcP 復合物 I 和 CcP 復合物 II，分別是四價和三價鐵離子與氧絡合形成的復合物）。反應起始，兩個吲哚環(huán)N-H 上各失去一個質(zhì)子并伴隨一個額外電子的轉(zhuǎn)移，隨后兩個吲哚環(huán) C-C 連接并發(fā)生 N-C-H 的互變異構形成最終產(chǎn)物。然而，由于 CPA 被 StaP 底物結(jié)合位點周圍一系列氫鍵束縛著，使吲哚環(huán)上的 C-H 和 N-H 離 Cpd I 或 Cpd II 太遠而不能直接發(fā)生反應，這就需要一個中介。Wang等[16]結(jié)合實驗和 QM/MM 計算法提出了氫鍵三元組：Wat644-His250-Wat789（StaP 的底物結(jié)合處具有一個質(zhì)子穿梭殘基 His250，兩個水分子 Wat644 和 Wat789）這三個組分可以把質(zhì)子從固定的 CPA 轉(zhuǎn)運到 Cpd I 的氧原子上。首先在三元組的幫助下發(fā)生“質(zhì)子耦合的電子轉(zhuǎn)移（PCET）”，即 CPA 失去一個電子到亞鐵血紅素的同時，鄰近的一個吲哚環(huán) N-H 失去一個質(zhì)子。環(huán)閉（C-C 連接）的形成是在Wat644-Wat789 幫助下失去第二個也是最后一個電子，即發(fā)生“鍵形成耦合的電子轉(zhuǎn)移（BFCET）”。隨后的實驗證明His250 不是反應發(fā)生所必需的，因為二元組Wat644-Wat789 在第一個電子轉(zhuǎn)移時也可以執(zhí)行催化作用（雖然效率只有 His250 存在時的 75%），從而得出二元組Wat644-Wat789 是此反應發(fā)生所必需的基本元素。芳基-芳基連接反應也存在于 P450 158A2 催化淡黃霉素（flaviolin）二聚體[17]形成及 P450 OxyC 催化萬古霉素（vancomycin）的生物合成中[18]。

環(huán)閉合后是吡咯環(huán)的脫羧和氧化。空間位阻及靜電相互作用利于脫羧反應的發(fā)生。通過芳基-芳基的連接，CPA的構象由扭曲的蝴蝶型轉(zhuǎn)變?yōu)槠矫娼Y(jié)構，進一步促進了CPA 的脫羧，避免羧基和平面吲哚咔唑核心的排斥。Howard-Jones 和 Walsh[15]實驗證實，StaP 在 CPA 形成中所起的作用只是連接兩個吲哚環(huán)（C-C），電子富集的吡咯環(huán)在有氧環(huán)境中不穩(wěn)定，在溶液中可自發(fā)脫羧和氧化，并且限速步驟是隨后的脫羧氧化而不是 C-C 連接。

2 星形孢菌素的外源表達

星形孢菌素最初發(fā)現(xiàn)于 Streptomyces Staurosporeus AM-2282。目前已經(jīng)報道的可以產(chǎn)生 STA 的菌株包括Streptomyces sp. TP-A0274[5]，Lentzea albida（formerly Streptomyces staurosporeus）[19]，Streptomyces longisporo fl avus DSM10189[20]，Lechevalieria aerocolonigenes subsp. Streptomyces Staurosporeus AM-2282[9]，Stretomyce sp.4138[21]。

目前報道的可以產(chǎn)生 STA 的異源宿主有 Streptomyces albus[22]，Streptomyces longisporo fl avus[22]，Streptomyces lividans[6]。其中 Salas 等[22]在 S. albus 體內(nèi)利用雙質(zhì)粒系統(tǒng)完整重建了 STA 的合成路徑。第一個質(zhì)粒（aglycone plasmid）含 STA 吲哚咔唑環(huán)合成基因（staO、staD、staP 和staC），STA 糖基轉(zhuǎn)移酶 staG 基因和負責吲哚咔唑核心與糖殘基第二個 C-N 連接形成的 staN 基因[23-24]。StaN 是P450s 的同系物，在此首次發(fā)現(xiàn) P450 同系物參與 C-N 鍵形成[23]。另一個質(zhì)粒（sugar plasmid）含氨基己糖合成基因（staE，staK，staJ，staI），有的還具有修飾糖殘基的O-甲基轉(zhuǎn)移酶和 N-甲基轉(zhuǎn)移酶基因（staMA，staMB）。STA氨基糖合成的前兩個步驟，由宿主 S. albus 提供的 StaA 和StaB 催化[22]。StaG 對于糖供體表現(xiàn)出一定的靈活性，能夠轉(zhuǎn)移多種脫氧己糖。在 S. albus 體內(nèi)共表達這兩種質(zhì)粒產(chǎn)生了星形孢菌素和一些糖基化的衍生物。當替換 sugar plasmid 時，StaG 和 StaN 可以轉(zhuǎn)移并連接這些糖基到吲哚咔唑環(huán)上，從而產(chǎn)生多種新型糖基化衍生物[25]，包括4 種單鍵連接的衍生物，左旋鼠李糖（L-rhamnose）、左旋橄欖糖（L-olivose）、左旋洋地黃毒素糖（L-digitoxose）、右旋橄欖糖（D-olivose）或 3 種雙鍵連接的衍生物（3 種 L 型糖形成的雙鍵化合物）。在第二個 C-N 鍵連接時，糖殘基需要從4C1-構象轉(zhuǎn)變?yōu)?C4-構象，而 D 型糖基可能由于熱力學和空間位阻效應，阻礙了第二個 C-N 鍵的形成。故雙C-N 連接只在 L 型糖中發(fā)生[22]。

星形孢菌素在異源宿主體內(nèi)表達產(chǎn)量沒有在原宿主體內(nèi)表達量高。STA 表達量在異源宿主 Streptomyces lividans 體內(nèi)是 2.6 mg/L（培養(yǎng) 9 d），而在原宿主體內(nèi)是10.5 mg/L[9]。

Cai 等[26]推測，STA 在微生物體內(nèi)處于甲酰化狀態(tài)。由于 STA 具有細胞毒性，當其在菌體內(nèi)產(chǎn)生時，可能被甲?；瘡亩Ｗo菌體不受自身代謝產(chǎn)物的毒害，當分泌到體外后去甲?；玫?STA。

3 星形孢菌素的生物功能及作用機制

STA 具有多種生物學功能，包括抗真菌，降血壓[27]，促血小板聚集等，其中最重要的是作為激酶抑制劑的抗腫瘤活性[3]。STA 與這些激酶的 ATP 結(jié)合域相互作用，這就解釋了為什么 STA 及其類似物（糖基與吲哚咔唑核心雙連接）的抑制活性缺乏選擇性。平面六環(huán)框架和碳水化合物部分在識別細胞內(nèi)目標物時均具有重要作用。在 STA-蛋白激酶結(jié)構中，糖苷配基部分恰好進入蛋白激酶的 ATP 結(jié)合域，大致疊合在 ATP 的嘌呤位置上，吲哚氮原子和糖基氫氧根形成關鍵的氫鍵[28]。

進一步的生化研究表明 STA 與 PKC 的催化區(qū)域結(jié)合，而 PKC 的催化區(qū)域與其他激酶的催化區(qū)域具有很大的相似性，這導致 STA 對激酶的選擇性極差，在抑制 PKC的同時也能抑制其他蛋白激酶。STA 對 PKC 異構酶的選擇性則幾乎沒有。

鑒于星形孢菌素的高活性，低選擇性，人們很自然以它作為先導化合物對其進行結(jié)構改造希望能找到選擇性的PKC 拮抗劑。通過對 STA 的改造，人們發(fā)現(xiàn)了第一個在體外能選擇性地拮抗 Ca2+依賴性與 Ca2+不依賴性的PKC 異構酶的化合物 GOE6976。隨后幾年又改造得到了多種具有潛在抗腫瘤活性的 STA 衍生物，如 NB-506 和BMY-27557。

4 展望

星形孢菌素是非常有效的蛋白激酶抑制劑，但缺乏選擇性，如果作為藥物，離人們預期還有很大距離。天然產(chǎn)物是藥物先導物的可靠來源，故研究者常以對 PKC 具有拮抗能力的天然化合物為先導物進行結(jié)構改造來獲得選擇性的PKC 拮抗劑。例如將 STA 的吲哚咔唑結(jié)構改為 2，3-雙吲哚馬來酰亞胺結(jié)構，使得化合物的選擇性提高。而從一些吲哚咔唑化合物產(chǎn)生菌中分離得到生物合成基因簇并應用組合生物合成技術（體內(nèi)合成途徑）在異源宿主體內(nèi)表達，得到的 STA 衍生物比生物轉(zhuǎn)化帶有細胞毒性的 STA 更有效，在增加化合物結(jié)構多樣性方面具有廣闊的應用前景，為產(chǎn)生高效的有選擇性的蛋白激酶抑制劑提供潛在可能。

對比于其他復雜天然產(chǎn)物的合成路徑，吲哚咔唑的合成途徑相對簡單，并且一些催化吲哚咔唑化合物合成的酶類具有一定程度的底物靈活性，利于產(chǎn)生多種新的衍生物。因此，在保持 STA 吲哚咔唑核心不變的情況下可以對糖基進行改造，例如當糖基連接到糖苷配基上以后可以進一步進行后糖基化修飾，例如甲基化或?；⊿TA 就是連接后甲基化產(chǎn)生）。另外，一種作為對體外糖類隨機化（IVG）補充的糖類隨機化新方法——新型糖類隨機化（neoglycorandomization）在制藥方面有巨大的潛力。已經(jīng)證明，此法可以提高強心苷的抗腫瘤活性[29-30]。

不論是用化學方法還是用生物合成方法對 STA 的吲哚咔唑核心或是糖殘基改造，都需要將兩部分連接，因此，糖基轉(zhuǎn)移酶是不可或缺的。只有對吲哚咔唑類糖基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構認識不斷深入才能提高 STA 衍生物的合成效率。

星形孢菌素市場價格昂貴，目前只用于醫(yī)學領域進行理論研究。可以通過選育來提高產(chǎn)生菌的發(fā)酵效價，構造更穩(wěn)定的菌株，從而真正擴大生產(chǎn)用于制藥工業(yè)。

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