應(yīng)用微生物生產(chǎn)維生素C的研究進(jìn)展

程朝彬，陳建華

維生素 C（vitamin C，VC）即 L-抗壞血酸（L-ascorbic acid，L-AA），是一種水溶性維生素，最早從腎上腺中分離得到[1]。人體中缺乏 L-古龍酸-1,4-內(nèi)酯氧化酶（L-gulono-1,4-lactone oxidase），無(wú)法自身合成 VC，必須依靠膳食攝取[2]。VC 生理功能廣泛，普遍用于臨床治療中[3]。此外，VC 在食品飲料、化妝品和飼料等工業(yè)中有著廣泛用途[4]。VC 應(yīng)用范圍的增加迅速加劇了市場(chǎng)需求，全球每年 VC的需求量約為 8 萬(wàn)噸，其中 55% 用于醫(yī)藥工業(yè)；35% 用于食品和飲料工業(yè)；10% 用于養(yǎng)殖工業(yè)[1]。

20 世紀(jì) 30 年代以前，VC 主要從檸檬中分離提取，價(jià)格高昂，遠(yuǎn)不能滿足人們的需要。1933 年首次實(shí)現(xiàn)用L-木酮糖（L-xylosone）化學(xué)合成 VC，在此基礎(chǔ)上 Bremus等[5]引入一步生物發(fā)酵將 D-山梨醇（D-sorbitol）轉(zhuǎn)化為L(zhǎng)-山梨糖（L-sorbose），實(shí)現(xiàn)從 D-葡萄糖化學(xué)合成 VC，并用于工業(yè)化生產(chǎn)?！叭R氏法”經(jīng)過(guò)大量的優(yōu)化改進(jìn)，然而由于其高能耗，一些化學(xué)反應(yīng)需要高溫、高壓條件，易造成環(huán)境污染等[6]，各國(guó)學(xué)者一直致力于尋找更經(jīng)濟(jì)、有效的替代工藝。于是，微生物轉(zhuǎn)化法的生物技術(shù)工藝逐漸被重視。這里，我們主要概述近年來(lái)用微生物生產(chǎn) VC 的研究進(jìn)展。

1 細(xì)菌合成 VC

在過(guò)去的 30 年中，利用細(xì)菌生物轉(zhuǎn)化替代現(xiàn)有的萊氏化學(xué)合成法生產(chǎn) VC 的研究取得豐碩成果。已發(fā)現(xiàn)的可用于生產(chǎn) VC 的細(xì)菌，多數(shù)不能直接合成 VC，一般是先合成一種關(guān)鍵中間體 2-酮基-L-古龍酸（2-keto-L-gulonic acid，2-KLGA），再經(jīng)甲醇酯化得到 VC。這些細(xì)菌以 D-葡萄糖（D-gulose）、D-山梨醇或 L-山梨糖為底物，根據(jù)生產(chǎn)2-KLGA 的生物途徑和菌株不同可分為：?jiǎn)尉臧l(fā)酵、混菌株發(fā)酵和基因工程菌株發(fā)酵。

1.1 單菌株發(fā)酵

Sugisawa 等[7]報(bào)道一株突變菌株，葡萄糖酸桿菌IFO3293（Gluconobacter melanogenus IFO3293）能以 D-山梨醇或 L-山梨糖為底物發(fā)酵生產(chǎn) 2-KLGA，最終產(chǎn)量分別為 50% 和 60%，但發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生副產(chǎn)物 L-艾杜糖酸（L-idonic acid）等，發(fā)酵液中分離純化 2-KLGA 困難，阻礙其用于工業(yè)生產(chǎn)。早前研究認(rèn)為只有葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）、醋酸桿菌屬（Acetobacter）和假單胞桿菌屬（Pseudomonas）能以 D-山梨醇和 L-山梨糖為底物合成 2-KLGA，但 Urbance 等[8]從生酮基古龍酸菌屬（Ketogulonicigenium）中分離出 2 株菌可以將 20 g/L 的L-山梨糖轉(zhuǎn)化為 9.3 g/L的 2-KLGA，最近研究報(bào)道用普通生酮基古龍酸菌 DSM 4025（Ketogulonicigenium vulgare DSM 4025）在 110 h 連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中，可以將 114 g/L L-山梨糖轉(zhuǎn)化為 112.2 g/L 的 2-KLGA，其平均底物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物的產(chǎn)率可達(dá) 91.3%[9]。

另有研究報(bào)道，K. vulgare DSM 4025 活細(xì)胞或靜息細(xì)胞均可利用 D-山梨醇、L-山梨糖、L-葡萄糖（L-gulose）和L-山梨醛（L-sorbosone）直接合成 VC，該菌目前報(bào)道最高的產(chǎn)量是以 5 g/L L-山梨醛為底物發(fā)酵制得 1.37 g/L的VC[10]。此外，Rao 和 Sureshkumar[11]利用放射性誘變野油菜黃單胞菌（Xanthomonas campestris）得到的新菌株可利用 D-葡萄糖直接合成 VC。與用化學(xué)方法從 2-KLGA 內(nèi)酯化合成 VC 相似，X. campestris 通過(guò)內(nèi)酯化 2-KLGA 合成 VC。在合適的培養(yǎng)基中該菌可以將 D-葡萄糖轉(zhuǎn)化為20.4 g/L的 VC，是酵母用 D-葡萄糖直接合成 VC 產(chǎn)量的14 倍。

1.2 混合菌株發(fā)酵

20 世紀(jì) 70 年代初，我國(guó)科學(xué)家建立了一種工業(yè)生產(chǎn)VC 的混菌發(fā)酵工藝，因其由兩個(gè)發(fā)酵步驟組成，故又稱為“二步發(fā)酵法”。該方法是目前唯一成功應(yīng)用于大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn)維生素 C的微生物轉(zhuǎn)化法，國(guó)內(nèi)的 VC 生產(chǎn)廠家均采用該法，并轉(zhuǎn)讓給許多西方生產(chǎn)廠商（如 Roche 公司等）[3, 12-13]。

二步發(fā)酵法是在萊氏一步發(fā)酵將 D-山梨醇轉(zhuǎn)化為 L-山梨糖之后，再利用混合菌培養(yǎng)發(fā)酵將 L-山梨糖轉(zhuǎn)化為VC 的前體 2-KLGA[5]，其第二步發(fā)酵是由產(chǎn)酸菌——氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydans）和其伴生菌混合發(fā)酵完成。該混合菌發(fā)酵體系中，氧化葡萄糖酸桿菌單獨(dú)培養(yǎng)困難且產(chǎn)酸能力很低；伴生菌單獨(dú)培養(yǎng)容易，不產(chǎn)酸，但可以促進(jìn)氧化葡萄糖酸桿菌的生長(zhǎng)和產(chǎn)酸。能與氧化葡萄糖酸桿菌混合培養(yǎng)并促進(jìn)其生產(chǎn) 2-KLGA 的伴生菌有很多，除常用的巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）外，蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus）、枯草芽孢桿菌（Bacilus subtilis）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）及蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）等均有該作用[12,14]。對(duì)于伴生菌和產(chǎn)酸菌之間的生理和代謝關(guān)系目前研究認(rèn)為：氧化葡萄糖酸桿菌中含有 2-KLGA 合成所必需的關(guān)鍵酶，而伴生菌在發(fā)酵過(guò)程中產(chǎn)生幾種蛋白質(zhì)或者小分子物質(zhì)[15]，這些組分的作用從而促進(jìn)小菌產(chǎn)生 2-KLGA。但大小菌之間具體的伴生機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

二步發(fā)酵法中 2-KLGA 的合成路線，Bremus 等[5]給予詳細(xì)的闡述：第一步發(fā)酵，D-葡萄糖經(jīng)中間體 D-葡萄糖酸（D-gluconate）和 2-酮基-D-葡萄糖酸（2-keto-D- gluconate）最終氧化成 2,5-二酮基-葡萄糖酸（2,5-diketo-D- gluconate），此過(guò)程是由歐文菌（Erwinia）或醋酸桿菌（Acetobacter）發(fā)酵完成。第二步發(fā)酵，一株棒狀桿菌（Corynebacterium）完成 2,5-二酮基-葡萄糖酸到 2-KLGA 的轉(zhuǎn)變，該反應(yīng)是由還原型輔酶 II（NADPH）依賴 2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶（2,5-diketo-D-gluconate reductase）催化完成的。因此，聯(lián)合幾種微生物如條紋假單胞菌（Pseudomonas striata）、氧化葡萄糖酸桿菌（Gluconobacter oxydan）和棒狀桿菌可以實(shí)現(xiàn)以 D-葡萄糖酸為底物直接合成 2-KLGA。

1.3 基因工程菌株

最早在草生歐文菌（Erwinia herbicola）中實(shí)現(xiàn)遺傳重組，構(gòu)建的工程菌能以葡萄糖為底物生產(chǎn) 2-KLGA。將Corynebacterium sp. 中 2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶轉(zhuǎn)化至草生歐文菌，得到的工程菌能以 D-葡萄糖為底物直接發(fā)酵生產(chǎn) 2-KLGA。在葡萄糖脫氫酶（glucose dehydrogenase）、葡萄糖酸脫氫酶（gluconate dehydrogenase）、酮葡萄糖酸脫氫酶（ketogluconate dehydrogenase）和 2,5-二酮-D-葡萄糖酸還原酶的作用下，構(gòu)建的工程菌發(fā)酵 120 h 內(nèi) 2-KLGA的產(chǎn)量達(dá)到 120 g/L[16]。

在野生葡萄糖酸桿菌屬（Gluconobacter）中僅有少數(shù)菌株可以在 D-山梨醇脫氫酶（D-sorbitol dehydrogenase）、L-山梨糖脫氫酶（L-sorbose dehydrogenase）和 L-山梨醛脫氫酶（L-sorbosone dehydrogenase）作用下以 D-山梨醇為底物合成 2-KLGA，其最終產(chǎn)率很低[17-18]。而通過(guò)基因工程改造葡萄糖桿菌屬菌株，可實(shí)現(xiàn)大量生產(chǎn) 2-KLGA[19]。Saito等[20]將 G. oxydans T-100 中編碼 L-山梨糖脫氫酶和 L-山梨醛脫氫酶的基因轉(zhuǎn)入 L-山梨糖（L-sorbose）生產(chǎn)菌株 G.oxydans G624 中，得到重組菌株可以高產(chǎn) 2-KLGA，產(chǎn)量達(dá)到130 g/L，是野生菌株產(chǎn)量的 230%。

另有研究報(bào)道，將液化醋化醋桿菌（Acetobacter liquefaciens）編碼 L-山梨醛脫氫酶的基因轉(zhuǎn)入 G. oxydans IFO 3293 中，新構(gòu)建的工程菌展示出很高的 L-山梨糖或L-山梨醛轉(zhuǎn)化 2-KLGA 的活性[21]。該工程菌株靜態(tài)細(xì)胞發(fā)酵系統(tǒng)利用 L-山梨糖生產(chǎn) 2-KLGA 的產(chǎn)量可達(dá) 40 g/L。

Shibata 等[22]將 G. oxydans 中編碼 D-山梨醇脫氫酶、L-山梨糖脫氫酶和 L-山梨醛脫氫酶的基因重組入一株惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基后，重組菌株可以將 50 g/L 的底物 D-山梨醇轉(zhuǎn)化為 16 g/L 的產(chǎn)物2-KLGA。但其中 15 g/L 的 D-山梨醇仍留在發(fā)酵液中未被利用，因此為使該重組菌用于工業(yè)生產(chǎn)，需提高 D-山梨醇脫氫酶基因的表達(dá)水平或選育能適應(yīng)高濃度山梨醇的菌株。

基因工程菌研究成果很多，重組的菌株或多或少的可以生產(chǎn) 2-KLGA，但沒(méi)有一株菌是可以直接將 D-葡萄糖、D-山梨醇或者它們的氧化物轉(zhuǎn)化為 VC。因此，可以轉(zhuǎn)化2-KLGA為 VC 的酶引起了學(xué)者的興趣。最近，Berry 等[23]報(bào)道 D-山梨醛脫氫酶能將 L-山梨醛轉(zhuǎn)化為 VC，相關(guān)的基因克隆自 G. oxydans N44-1 并可在同株菌種高表達(dá)。新菌株的靜息細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，可以將 10 g/L的 L-山梨醛轉(zhuǎn)化為4.2 g/L的 VC。

如上所述，目前實(shí)現(xiàn)工業(yè)利用 D-葡萄糖或 D-山梨醇生物合成 VC 仍然有很長(zhǎng)的一段路。因此，今后研究重點(diǎn)主要在提高基因表達(dá)、優(yōu)化發(fā)酵條件、限制副產(chǎn)物生成等。

2 酵母合成 VC

雖然在酵母浸出液中發(fā)現(xiàn)了 VC，但自然條件下的酵母并不能合成 VC。相反，酵母可以合成一種 VC 類似物D-紅抗壞血酸（D-erythroascorbic acid，D-EAA）[1]。盡管該物質(zhì)的結(jié)構(gòu)與 VC 不同，但其具有相似的氧化-還原性質(zhì)，在酵母中起著與 VC 相似的抗氧化作用[24]。因此，D-EAA 可代替 VC 運(yùn)用于工業(yè)生產(chǎn)中，但 D-EAA 沒(méi)有抗壞血病作用，因此其商業(yè)價(jià)值不及 VC[5]。

研究發(fā)現(xiàn)酵母中合成 D-EAA 最后的兩步與植物中合成 VC 的步驟極其相似。D-阿拉伯糖（D-arabinose）被轉(zhuǎn)化為 D-阿拉伯糖膠-1,4-內(nèi)酯（D-arabinono-1,4-lactone），最后被氧化為 D-EAA，該過(guò)程中分子結(jié)構(gòu)構(gòu)型改變與植物中L-半乳糖（L-galactose）經(jīng) L-半乳糖-1,4 內(nèi)酯（L-galactono-1,4-lactone）合成 VC 的分子構(gòu)型改變完全相同[1]?？墒?，此過(guò)程中相關(guān)的酶 L-半乳糖-1,4內(nèi)酯化脫氫酶（L-GL-DH，植物）和 D-阿拉伯糖膠-1,4-內(nèi)酯氧化酶（D-AL-Ox，酵母細(xì)胞）的催化性質(zhì)完全不同。體外實(shí)驗(yàn)表明從白色念珠菌（Candida albicans）和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）中分離純化的 D-AL-Ox 不僅可以催化利用 L-阿拉伯糖膠-1,4-內(nèi)酯（L-arabinono-1,4-lactone），還可以利用 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯（L-galactono-1,4-lactone ）和 L-古龍酸-1,4-內(nèi)酯（L-gulono-1,4-lactone）。此外，C. albicans還能以 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯為底物發(fā)酵生產(chǎn) VC[25-26]。

酵母中催化合成 D-EAA 最后兩步中的 D-阿拉伯糖脫氫酶（D-arabinose dehydrogenase, D-Ara-DH），同樣有著廣泛的底物適用范圍。體外實(shí)驗(yàn)證明，從 C. albicans 和S. cerevisiae中分離的該酶不僅可以利用 D-阿拉伯糖合成D-阿拉伯糖膠-1,4內(nèi)酯，還可以利用 L-半乳糖合成 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯。S. cerevisiae 中相關(guān)功能基因已被克隆，并且敲除該基因會(huì)導(dǎo)致該菌合成 D-EAA 功能的完全缺失[27]。另?yè)?jù)研究顯示 S. cerevisiae 經(jīng) L-半乳糖孵育后細(xì)胞內(nèi)有VC 生成，這有可能是因?yàn)閮?nèi)源性的 D-AL-Ox 和 D-Ara-DH 活性所致[25]。

D-EAA 生物合成的多種途徑為開(kāi)拓酵母一步發(fā)酵生產(chǎn)VC 提供新的研究方向。目前已經(jīng)有報(bào)道經(jīng)基因工程改造的S. cerevisiae 和拜耳結(jié)合酵母（Zygosaccharomyces bailii）可以生產(chǎn) VC。過(guò)表達(dá) S. cerevisiae 中 D-Ara-DH 和 D-ALOx 可顯著增加其以 L-半乳糖為底物生產(chǎn) VC 的能力。在出芽酵母細(xì)胞轉(zhuǎn)入內(nèi)源性的 D-AL-Ox 和擬南芥（Arabidopsis thaliana）中 L-半乳糖脫氫酶（L-galactose dehydrogenase），構(gòu)建的工程菌可以轉(zhuǎn)化 40% 的底物 L-半乳糖，得到100 mg/L 的 VC[28]。

然而，酵母不能合成 L-半乳糖或其衍生物，需要外部供給。這些物質(zhì)的成本較高，使得該生產(chǎn)方法不經(jīng)濟(jì)，解決方案：①篩選可以利用廉價(jià)的底物合成 L-半乳糖的細(xì)菌菌株，并與酵母混合發(fā)酵；②構(gòu)建載有合成 D-EAA 全部基因的原核生物工程菌；③利用遺傳工程改造酵母使其載有合成VC 的全套基因，以期適用于工業(yè)生產(chǎn)。

3 微藻類合成 VC

嘗試使用微藻這種廉價(jià)的原料直接生產(chǎn) VC 是近年來(lái)微生物生產(chǎn) VC 新方向。Running 等[29]報(bào)道淀粉核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）可以一步發(fā)酵 VC，該野生型的細(xì)胞 VC 產(chǎn)量?jī)H 40 mg/L，經(jīng)化學(xué)誘變和對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，其產(chǎn)量可提高至 2 g/L。但大部分的 VC 存留在微藻的細(xì)胞內(nèi)，目前該方法僅被用來(lái)制作高營(yíng)養(yǎng)的動(dòng)物飼料和食品添加劑[1]。Running 等利用誘變育種技術(shù)得到 1 株 Prototheca moriformis ATCC 75669，可以將合成的 VC 分泌到胞外，同時(shí) VC 產(chǎn)量比原始菌也有很大的提高[30]。

此外經(jīng)過(guò)不斷改良品系，Running 等[30]從原壁菌屬（Prototheca）選育出眾多能夠合成VC 的突變株，這些突變菌株被用于幫助研究一條涉及含有甘露糖的中間體生物合成 VC的途徑。在植物中，D-葡萄糖經(jīng) GDP-D-甘露糖（GDP-D-mannose）、GDP-L-半乳糖（GDP-L-galactose）、L-半乳糖合成 L-葡糖酸-1,4-內(nèi)酯，最終 L-半乳糖-1,4-內(nèi)酯被 L-GL-DH 轉(zhuǎn)化為 VC。該途徑最早分別由Bremus等[5]在 P. moriformis 和尚增振等[31]在高等植物中發(fā)現(xiàn)。

微藻中 VC 合成途徑的闡明有助于其在基因工程上的改造，從而提高 VC 產(chǎn)量并用于工業(yè)化生產(chǎn)。但由于微藻培養(yǎng)的緩慢生長(zhǎng)速度和代謝活性，要實(shí)現(xiàn)其工業(yè)生產(chǎn) VC仍有很長(zhǎng)一段路要走。

4 展望

目前，用于工業(yè)化生產(chǎn) VC 的方法主要是“萊氏法”和“二步發(fā)酵法”。“萊氏法”因其種種弊端，已經(jīng)失去了 VC生產(chǎn)的主導(dǎo)地位。而“二步發(fā)酵法”雖然解決了萊氏化學(xué)合成過(guò)程的“三廢”等問(wèn)題，但該方法涉及二步三種菌，菌種傳代困難，操作工序繁瑣，不能直接把葡萄糖作為發(fā)酵原料。因此，今后的研究重點(diǎn)是利用基因工程技術(shù)，重組構(gòu)建新型工程菌株，實(shí)現(xiàn)以葡萄糖為底物直接生產(chǎn) VC 的一步發(fā)酵途徑。

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