山梨糖與羥脯氨酸的美拉德反應(yīng)條件優(yōu)化及抗氧化研究

張改紅等

摘要：以山梨糖和羥脯氨酸為原料，通過單因素試驗和正交試驗，確定了較佳的美拉德反應(yīng)條件，即當(dāng)反應(yīng)溫度為160 ℃，反應(yīng)時間5 h，pH為8，山梨糖和羥脯氨酸摩爾比為1∶2時，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量最好。通過測定反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率，結(jié)果表明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以作為抗氧化劑。利用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對反應(yīng)產(chǎn)物進行了分離鑒定，檢測到吡嗪、吡咯、吡啶等雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)是卷煙中的重要香氣成分，為卷煙加香提供了一定的理論基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：山梨糖；羥脯氨酸；美拉德反應(yīng)；卷煙增香

中圖分類號：TS264.3 文獻標(biāo)識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）13-3133-04

Optimizing Conditions of Maillard Reaction for Sorbose and Hydroxyproline

and Its Antioxidation

ZHANG Gai-hong，CHENG Chuan-ling，YANG Yan-qin，SONG Hui，LI Rui-li，WANG Jian-min

（School of Food and Biological Engineering， Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： Using sorbose and hydroxyproline as materials， the conditions of maillard reaction were optimized with single factor experiment and orthogonal test. When the reaction temperature was 160 ℃， reaction time was 5 h， the pH was 8， sugar ammonia molar ratio was 1∶2， cigarette perfuming effect of the maillard reaction products were the best. By measuring the clearance efficiency of DPPH free radical， the maillard products were proved to be as antioxidant. With gas chromatograph-mass spectrometer， some heterocyclic compounds such as pyrazine， pyrrole and pyridine were isolated and identified from the reaction products， which were the important aroma components in tobacco. It will provide a theoretical basis for enhancing cigarette perfuming.

Key words： sorbose； hydroxyproline； maillard reaction； cigarette perfuming

1912年，法國化學(xué)家美拉德（Louis-Camille Maillard）發(fā)現(xiàn)把葡萄糖和甘氨酸在水中加熱一段時間，形成褐色的類黑精。1953年Hodge[1]把這個反應(yīng)正式命名為美拉德反應(yīng)。由于美拉德反應(yīng)是煙草特征香味形成的重要反應(yīng)，產(chǎn)物中含有許多香味成分，而且大部分與煙香諧調(diào)，因此，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙增香方面的應(yīng)用研究倍受青睞[2-5]。以山梨糖和羥脯氨酸為原料的美拉德反應(yīng)及其產(chǎn)物在卷煙中的應(yīng)用還未見報道。本試驗以山梨糖和羥脯氨酸為原料，通過單因素和正交試驗優(yōu)化了反應(yīng)條件，考察了其產(chǎn)物的抗氧化效果，并用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對反應(yīng)產(chǎn)物進行了分離鑒定，為卷煙加香提供了一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

D-山梨糖、L-羥脯氨酸（生化試劑，北京中生瑞泰科技有限公司）；1，2-丙二醇（分析純）；丙三醇（分析純）；無水硫酸鈉、乙醚（分析純，天津市德恩化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器與設(shè)備

98-3型數(shù)顯磁力攪拌器（鄭州凱鵬實驗儀器有限公司）、PL-203型電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易上海公司）、Agilent 6890-5973型氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀（安捷倫公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

1）單因素試驗。主要研究不同的反應(yīng)溫度（100、120、140和160 ℃）、反應(yīng)時間（2、3、4和5 h）；初始pH（6、8、9和10）、山梨糖和羥脯氨酸摩爾比（2∶1、1∶1、1∶2和1∶3）對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中加香效果的影響。在測定某一因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物加香效果的影響時，固定其他因素及其水平不變。

以反應(yīng)溫度為例，具體反應(yīng)過程為：稱取摩爾比為1∶1的山梨糖和羥脯氨酸，加入20 mL的丙二醇，用10%的NaOH溶液或者6 mol/L HCl調(diào)節(jié)pH為8，將其加入裝有溫度計、回流冷凝管和磁子的50 mL的圓底三口燒瓶中，置于放有油浴鍋的磁力攪拌器上，30 min內(nèi)分別加熱至100、120、140、160 ℃，回流反應(yīng)2 h。其他因素下的反應(yīng)如上述，將相應(yīng)的因素水平替換即可。

2）卷煙加香評吸試驗。將不同因素不同水平下的反應(yīng)產(chǎn)物用70%的乙醇溶液稀釋成10%的溶液。取8 g煙絲，添加上述10%美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的乙醇溶液40 mg（按煙草質(zhì)量的0.5%添加）；另取8 g煙絲，添加40 mg的70%乙醇溶液作為對照。將煙絲灌入空煙筒中（單支煙絲重750～800 mg），卷制成的煙支在相對濕度（60±3）%，溫度（22±1） ℃的恒溫恒濕箱中平衡48 h。組織專業(yè)人員對各試驗卷煙進行對比評吸。評吸采用單支打分法，分別從卷煙的香氣、諧調(diào)、雜氣、刺激性、余味等5個方面進行評分（滿分95分，5個方面的分值分別為32、6、12、20、25分），以空白樣為標(biāo)準(zhǔn)作相對比較評價。感官評價依據(jù)參考文獻[6]進行。

3）正交試驗。在單因素試驗的基礎(chǔ)上進行正交試驗，每個因素選取4個水平，以美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的A420 nm為考察指標(biāo)，用方差分析的方法對結(jié)果進行處理，確定因素的主次順序和最優(yōu)水平以及最優(yōu)組合。正交試驗因素與水平見表1。

1.3.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性的測定 清除DPPH自由基的測定[7，8]。

取不同濃度（稀釋倍數(shù)分別為10、25、50、100）的最佳反應(yīng)條件下的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物樣液3 mL于10 mL的比色管中，再加入3 mL的1×10-4 mol/L的DPPH溶液，混合后搖勻，于室溫避光條件下靜置30 min，用無水乙醇和水的混合液（體積比為1∶1）作參比，在517 nm處測吸光度。清除率按下式計算：

清除率=[1-（At-Ab）/Ac]×100%

式中，At為加入美拉德反應(yīng)產(chǎn)物后DPPH溶液吸光度，Ab為美拉德反應(yīng)產(chǎn)物與等體積無水乙醇的吸光度，Ac為未加美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的DPPH溶液吸光度（對照）。

1.3.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS分析 取10 mL的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物（最佳反應(yīng)條件下的產(chǎn)物），放入125 mL的分液漏斗中，加入15 mL飽和NaCl溶液，然后用25 mL的乙醚萃取3次。每次10～15 min，合并3次萃取液，用無水硫酸鈉干燥過夜，過濾后濾液倒入具有刻度的濃縮瓶里，常壓濃縮至1 mL，然后進行GC-MS分析。

GC-MS分析條件：色譜柱：HP-5MS（60 m×250 μm i.d.×0.25 μm d.f.）彈性石英毛細管柱；程序升溫：50 ℃保持2 min，以5 ℃/min升溫至280 ℃，保持20 min；進樣口溫度：270 ℃；進樣量：1.0 μL；分流比：5∶1；載氣：氦氣；流速：1 mL/min。檢測器溫度：270 ℃；溶劑延遲6.5 min，EI源電子能量：70 eV；離子源溫度：230 ℃；四級桿溫度：150 ℃；質(zhì)量掃描范圍：30～550 amu。采用NIST11標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索定性，峰面積歸一化法定量。

2 結(jié)果與分析

2.1 美拉德反應(yīng)條件的優(yōu)化

2.1.1 美拉德反應(yīng)單因素試驗結(jié)果

1）反應(yīng)溫度對反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中加香效果的影響。由表2可知，隨著反應(yīng)溫度的升高，美拉德產(chǎn)物的增香效果逐漸變好。在選定的4個溫度水平下，160 ℃下反應(yīng)得到的產(chǎn)物增香效果較好，所以反應(yīng)溫度以160 ℃為宜。

2）反應(yīng)時間對反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中加香效果的影響。由表3可知，在2～4 h內(nèi)，隨著反應(yīng)時間的延長，美拉德產(chǎn)物的增香效果逐漸變好，但當(dāng)反應(yīng)時間超過4 h以后，產(chǎn)物的增香效果反而下降，這可能是由于隨著時間的延長，香味物質(zhì)逐漸分解或者轉(zhuǎn)化為其他的物質(zhì)。綜合來看，反應(yīng)時間以4 h為宜。

3）初始pH對反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中加香效果的影響。由表4可知，初始pH對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中的加香效果也有較大的影響。隨著初始pH的升高，產(chǎn)物的加香效果逐漸增強，但當(dāng)pH大于9時，產(chǎn)物的加香效果反而下降。因此，初始pH以9為宜。

4）山梨糖與羥脯氨酸摩爾比對反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中加香效果的影響。由表5可知，山梨糖和羥脯氨酸摩爾比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中的加香效果也有影響。隨著山梨糖與羥脯氨酸摩爾比減小，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物在卷煙中的加香效果逐漸增強，但當(dāng)其比例小于1∶2時，產(chǎn)物的加香效果出現(xiàn)下降，因此，山梨糖與羥脯氨酸的摩爾比以1∶2為宜。

2.1.2 美拉德反應(yīng)的正交試驗結(jié)果 各反應(yīng)進行之后，各取1 mL美拉德反應(yīng)產(chǎn)物體系溶于10 mL的去離子水中，以去離子水為參比，在T6新世紀(jì)紫外分光光度計上于420 nm波長下測定其吸光度[9-11]。吸光度的大小反映美拉德反應(yīng)產(chǎn)物質(zhì)量的好壞。在一定范圍內(nèi)，吸光度越大說明反應(yīng)程度越深，反應(yīng)速度越快，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的質(zhì)量越好。試驗結(jié)果和方差分析分別見表6和表7。由表6和表7結(jié)果可知，各因素對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的影響從大到小分別為反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、山梨糖與羥脯氨酸摩爾比、初始pH。美拉德反應(yīng)的最優(yōu)條件組合為A4B4C2D3，即反應(yīng)溫度160 ℃，反應(yīng)時間5 h，pH為8，山梨糖與羥脯氨酸摩爾比為1∶2。

2.2 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物抗氧化性能的測定

美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率如表8所示。由表8可見，美拉德反應(yīng)產(chǎn)物可以有效清除DPPH自由基，在一定的范圍內(nèi)隨著其濃度的降低，清除DPPH自由基的能力也隨之減弱。稀釋25倍時，反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除率最高，達70.87%，說明美拉德反應(yīng)產(chǎn)物對DPPH自由基的清除活性較高，是很好的抗氧化物質(zhì)，這為其在卷煙中的應(yīng)用提供了一定的理論基礎(chǔ)。

2.3 美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的GC-MS分析

利用氣質(zhì)聯(lián)用儀對山梨糖與羥脯氨酸的美拉德反應(yīng)產(chǎn)物的醚溶性香味成分進行分離、鑒定，并利用面積歸一化法測定了各種成分的含量，其結(jié)果見表9。由表9可知，反應(yīng)產(chǎn)物共鑒定出11種成分。在鑒定出的11種成分中，主要為吡嗪、吡咯、吡啶等雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)是卷煙中的重要香氣成分，但含量相對微弱，其中以吡嗪類物質(zhì)的含量較高。吡嗪類物質(zhì)產(chǎn)生烘烤香，可顯著增加卷煙香氣，同時降低其刺激性，在改善卷煙的感官品質(zhì)方面有著重要的應(yīng)用價值。

3 小結(jié)與討論

本試驗主要考察了反應(yīng)溫度、反應(yīng)時間、初始pH、山梨糖與羥脯氨酸的摩爾比對美拉德反應(yīng)產(chǎn)物加香效果的影響，確定了其較佳反應(yīng)條件：反應(yīng)溫度160 ℃，反應(yīng)時間5 h，pH為8，山梨糖與羥脯氨酸的摩爾比為1∶2，此條件下，反應(yīng)產(chǎn)物的卷煙加香效果好；同時該產(chǎn)物可以有效清除DPPH自由基。

對反應(yīng)產(chǎn)物進行GC-MS分析，檢測到吡嗪、吡咯、吡啶等雜環(huán)化合物，這些物質(zhì)是卷煙中的重要香氣成分。在卷煙焦油含量降低的同時，致香成分也隨之減少。美拉德反應(yīng)可以產(chǎn)生煙草的重要香味成分，其產(chǎn)物可以減少煙草的澀度和苦味，起到增加香氣、降低刺激性的作用。因此，美拉德反應(yīng)值得進一步研究。

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